Rapports d’oncologie

Introduction

Bien que de nouveaux traitements aient récemment été introduits dans la pratique clinique pour le traitement du cancer avancé du prostate, le cancer de la prostate est resté le deuxième cancer le plus mortel chez les hommes aux États-Unis en 2014 (1). De nouvelles cibles et stratégies thérapeutiques sont urgentes pour améliorer encore les résultats cliniques des patients atteints de cancer de la prostate.

Une cible thérapeutique potentielle prometteuse est la kinase 5 dépendante de la cycline (CDK5). CDK5 est une sérine/thréonine kinasestructurellement similaire aux autres CDK (2). CDK5 ne semble pas avoir de rôle majeur dans la régulation du cycle cellulaire (3,4). Il a été bien caractérisé pour son rôle dominant dans le développement du système nerveux central, y compris les rôles dans la migration, la différenciation et l’adhésion neuronales (5,6). Nous et d’autres ont ensuite montré que CDK5 joue un rôle important dans le développement du cancer et les métastases (7-12). Dans les cellules cancéreuses de la prostate, nous avons démontré que CDK5 était critique pour l’intégrité squelettique, la migration et l’invasion cellulaires, et invivo, pour les métastases (7). Dans le cancer du Pancréas, CDK5 est intrinsèque à la signalisation KRAS par la voie de transduction du signal RAL, d’une importance centrale, fournissant ainsi une cible potentielle « droguable » pour les tumeurs KRAS mutantes (8). Ensemble, ces études indiquent que l’inhibition de CDK5, seule ou en association avec d’autres agents, peut fournir une stratégie thérapeutique efficace pour ces types de cancer et d’autres.

Dans la présente étude, nous avons cherché à identifier des agents qui seraient particulièrement efficaces en association avec l’inhibition de CDK5 dans les cellules cancéreuses de la prostate. Par conséquent, nous avons effectué un écran de la bibliothèque de médicaments Johns Hopkins (JHDL). Le JHDL est une collection de 3 360 composés pharmaceutiques qui ont réussi des tests de sécurité complétés chez l’homme pour une variété d’applications (13,14). Cette bibliothèque a été utilisée avec succès pour la réutilisation de composés pour le traitement du cancer, y compris l’identification de la digoxine comme inhibiteur de HIF1a (15) et de l’itraconazole comme inhibiteur de l’angiogénèse (16). Nous avons précédemment utilisé le JHDL pour identifier des composés de bromure de cétrimonium et d’irinotécane présentant une activité antitumorale accrue contre les cellules cancéreuses de la prostate exprimant de faibles niveaux du gène suppresseur de métastases N-gène 1 (NDRG1) (17).Ici, nous avons effectué un dépistage JHDL similaire avec des cellules cancéreuses de la prostate dont l’activité CDK5 diffère. La tilorone a été identifiée comme étant associée à une létalité synthétique in vitro des cellules cancéreuses de la prostate déficientes en DCK5.

Matériaux et méthodes

Culture cellulaire

Des lignées cellulaires de cancer de la prostate PC3 ont été obtenues à partir d’ATCC. Ces cellules proviennent d’une métastase osseuse d’un patient atteint d’un cancer de la prostate âgé de 62 ans. Les fibroblastes de la prostate humaine, gentiment fournis par le Dr J. Isaacs, ont été obtenus à partir d’une biopsie de la prostate sur un patient atteint d’un cancer de la prostate âgé de 62 ans avec un score de Gleason de 4. Les lignées cellulaires ont été cultivées et maintenues dans des milieux RPMI-1640 (Invitrogen) additionnés de sérum fœtal bovin à 10%. Les cellules ont été cultivées dans un incubateur humidifié à 37°C dans une atmosphère à 5% de CO2atmosphère.

Création de la lignée cellulaire PC3 CDK5dn

La perte de la fonction CDK5 a été réalisée dans des cellules PC3 par transfection d’une construction dominante négative contenant une mutation D144N, gracieusement fournie par le Dr L.H. Tsai (Harvard Medical School) (18). Le protocole utilisé a été décrit précédemment (7). En bref, la construction a été sous-clonée dans un vecteur Tet bidirectionnel, pBI-EGFP (BD Biosciences), auquel un gène de résistance à la zeocine a été ajouté pour la sélection (gentiment fourni par le Dr K. Schuebel, École de médecine de l’Université Johns Hopkins). Le vecteur vide pBI-EGFP ou le vecteur PBI-EGFPCDK5dn a été transfecté dans des cellules PC3 contenant une construction de promoteur aTet-Off, pTTa (BD Biosciences).

Western blot

Western blot a été effectué comme décrit précédemment (19). Dix microgrammes deprotéine ont été chargés sur le gel. Les anticorps primaires ont été dissous dans un tampon bloquant. Une dilution de 1: 1 000 a été utilisée pour l’anti-CDK5 (Sigma-Aldrich); l’anti-vinculine (Millipore, Nord de l’État) a été diluée de 1: 4 000. Les anticorps secondaires ont été dilués à une dilution de 1: 4 000. La normalisation de l’intensité de la bande a été effectuée avec la protéine vinculine de la femme de ménage. Les blots développés ont étécansés à l’aide d’un scanner Microtek.

Essai de cicatrisation

Des essais de cicatrisation ont été réalisés avec des cellules témoins confluentPC3 (contenant le vecteur pBI-EGFP vide) ou PC3 CDK5DN. Un grattoir à pointe de caoutchouc a été utilisé pour gratter une zone de cellules. Des images au microscope optique ont été capturées immédiatement et 24 hafter ont été grattés.

Criblage de bibliothèques de petites molécules

La bibliothèque JHDL a été décrite précédemment (13,14,17).Le stockage et le criblage des composés JHDL ont été effectués comme décrit précédemment (17).Brièvement, les cellules témoins PC3 et CDK5dn ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits (1×103 cellules/puits) et laissées adhérer pendant une nuit. Ensuite, 5 µl de médicaments, stockés sous forme de solutions mères de 200 µM inDMSO / H2O, ont été ajoutés au milieu RPMI complet, de sorte que les cellules ont été traitées à une concentration finale de 10 µM. Après 48 h de traitement, 20 µl de réactif MTS provenant du test de Prolifération cellulaire AqueousNon Radioactif CellTiter 96™ ont été ajoutés dans chaque puits pendant une durée de 2-4 h à 37°C. Les plaques ont été analysées à l’aide du lecteur de plaques aSoftMax Pro (Molecular Devices). La prolifération des cellules traitées a été comparée à la prolifération des cellules PC3control ou CDK5dn traitées au DMSO (indice de prolifération). Les indices de prolifération des cellules PC3 CDK5dn ont été comparés aux indices de prolifération des cellules témoins PC3. Une étude PubMed a été réalisée pourévaluer l’utilisation clinique des hits potentiels.

Dosages MTS

Des dosages MTS ont été réalisés pour mesurer l’effet antiprolifératif du traitement à la tilorone. Le dichlorhydrate de tiloronedihydrochlorure (Sigma-Aldrich) a été stocké sous forme de solution de stock de 10 mM dans du DMSO à -20°C. Un millier de cellules PC3 ont été plaquées dans des plaques à 96 puits contenant des milieux RPMI complets de 100 µl. À environ 50 % de confluence, le dichlorhydrate de tilorone a été administré. Pour les expériences, le composé a été dilué dans un milieu RPMI complet pour obtenir la concentration finale souhaitée. Après un traitement de 72 h (tilorone en monothérapie), le réactif MTS a été ajouté et l’absorption à 490 nm a été déterminée à l’aide d’un lecteur de plaques SoftMax Pro.Des indices de prolifération ont été calculés; des cellules de contrôle PC3 ouCDK5dn non traitées (dans un milieu RPMI complet de 103 µl) ont été utilisées comme contrôle. Les tests t de Student ont été effectués pour évaluer les valeurs p.

Essais clonogènes

Des essais clonogènes ont été réalisés pour évaluer la survie à long terme après traitement à la tilorone. Les cellules cancéreuses de la prostate étaientplaqué dans des boîtes de 60 mm et laissé adhérer. À 50-60% de confluence, les cellules ont été traitées avec de la tilorone pendant 72 h. Par la suite, 1× 103 cellules de chaque boîte ont été plaquées en trois exemplaires dans des boîtes de 60 mm et incubées dans un milieu RPMI complet pendant 12 jours.Les colonies sont fixées et colorées avec une solution contenant 90% de méthanol et 10% de solution de violet cristallin (2,3% de violet cristallin, 0,1% d’oxalate d’ammonium et 20% d’alcool éthylique; Sigma). Les colonies ont été scannées avec un scanner informatique (Microtek) et comptées manuellement.Les tests t de Student ont été effectués pour évaluer si les différences entre les lignées cellulaires étaient statistiquement significatives.

Essai de croissance 3D

Des essais de croissance 3D ont été réalisés en utilisant le même protocol que décrit précédemment (17). En bref, des sphéroïdes ont été générés par la culture de cellules PC3 pendant 16 h sous forme de goutte suspendue au-dessus d’une plaque humidifiée dans un incubateur à CO2 en milieu RPMI complet contenant 0,5% de méthylcellulose. Les sphéroïdes ont été incorporés dans une matrice de collagène (BD Biosciences), traités avec de la tilorone et imagés à l’aide d’un microscope Nikon Eclipse Ti (Nikon) le jour du traitement et six jours après le début du traitement. Les zones sphéroïdes et totales (germes sphéroïdplus) ont été mesurées avec ImageJ. Les augmentations de pli ont été calculées en divisant la surface sphéroïde / totale au jour 6 par la surface sphéroïde / totale au jour 0 pour chaque sphéroïde individuel. Pour chaque ligne de cellule et chaque point temporel, des augmentations de pli de quatre sphéroïdes ont été réalisées. Des analyses statistiques ont été effectuées à l’aide de tests de Student’st.

Résultats

Suppression de l’activité CDK5

Les cellules de cancer de la prostate PC3 ont été choisies pour le criblage composé de JHDL en raison de leur potentiel hautement métastatique et de leur indépendance en androgènes, ressemblant ainsi à un cancer de la prostate résistant aux métastases agressives. L’activité CDK5 a été inhibée par la transfection et la sélection d’une mutation dominante négative (CDK5144N). Ces cellules PC3 CDK5dn présentaient un taux de protéines totalCDK5 plus élevé que les cellules témoins PC3 (cellules PC3 transfectées avec un vecteur vide) (Fig. 1 BIS). Un essai de cicatrisation (8) a confirmé que CDK5 était fonctionnellement inactif dans ces cellules; contrairement aux cellules PC3control, les cellules PC3 CDK5dn n’avaient pas la capacité d’envahir la surface raclée (Fig.1B).

Écran de bibliothèque pour des composés ciblant des cellules PC3 sur la base de l’activité CDK5

Un test de criblage à haut débit a été effectué pour sélectionner des composés ciblant des cellules PC3 sur la base de l’activité CDK5. Les cellules PC3control et CDK5dn ont été traitées avec tous les composés du JHDL à 10 µM pendant 48 h. Pour identifier les hits ciblant sélectivement les cellules CPC3 sur la base de l’expression de CDK5, nous avons sélectionné tous les composés dont le rapport d’indice de prolifération (CDK5dn / contrôle) était inférieur à 0,5 ou supérieur à 1,5 (Fig. 2 BIS).De plus, les hits devaient inhiber la prolifération cellulaire des cellules PC3 d’au moins 10%, car nous nous intéressions spécifiquement aux composés qui inhibaient la croissance cellulaire (ligne horizontale et verticale du graphique). Nous avons également sélectionné tous les composés qui inhibaient la prolifération cellulaire des cellules C3 de 70% (coin inférieur gauche du graphique), car nous étions intéressés à identifier des antitumoragents potentiels très efficaces. Au total, 41 visites ont été sélectionnées pour une évaluation plus approfondie.

Un écran secondaire a été réalisé dans lequel des cellules sélectionnées de l’écran primaire ont été ajoutées à 10 µM pendant 48 h aux cellules PC3control et CDK5dn en trois exemplaires, pour éliminer les résultats faux positifs (Fig. 2B). Les valeurs de coupure étaient légèrement moins strictes que dans l’écran principal; les composés étaient considérés comme un succès lorsque le rapport des indices de prolifération (CDK5dn / contrôle) était inférieur à 0,7 ou supérieur à 1,4. Cela a abouti à l’identification de trois composés qui ciblent sélectivement les cellules PC3 exprimant le CDK5: rutilantine, lactate d’éthacridine et chlorure de cétalkonium (Fig. 2C).Ces composés n’ont pas été utilisés comme agents antitumoraux et leur utilisation clinique potentielle comme agents antitumoraux intraveineux semble limitée (20-23). Un autre composé, la tilorone analogR9536-DA, a été très efficace pour inhiber les deux lignées cellulaires isogènes PC3 (inhibition > 70%), mais il a inhibé la prolifération des cellules PC3CDK5dn un peu plus efficacement (rapport CDK5dn / contrôle: 0,687). La tilorone et ses analogues ont une activité antivirale, agissant au moins en partie comme inducteurs d’interféron (24-26) et il a également été démontré, précliniquement et cliniquement, une antitumoractivité (27,28).

La Tilorone cible sélectivement les cellules PC3 avec une faible activité CDK5

Nous avons poursuivi nos expériences avec du dichlorhydrate de tilorone fraîchement dissous. Après 72 h de traitement à la tilorone à différentes concentrations, sa CI50 a été établie à 8-12 Μm dans les cellules PC3 CDK5dn et à 15 µM dans les cellules témoins PC3 dans les dosages MTS (Fig. 3 BIS). À 8 µM, l’activité de prolifération a été diminuée de 24 et 47 % dans les cellules témoins PC3 et CDK5DN, respectivement (p = 0,001). Pour évaluer la toxicité de la tilorone dans les cellules normales de la prostate, des tests MTS ont été effectués avec un traitement par tiloronetraitement des fibroblastes de la prostate humaine (Fig. 3B). La sensibilité de ces cellules à la totilorone était similaire à celle des cellules témoins PC3.

L’effet inhibiteur de la tilorone dans les cellules PC3 a été encore évalué en effectuant des dosages clonogènes (Fig. 3C). Les cellules PC3 CDK5dn étaient également nettement plus sensibles que les cellules témoins PC3 à la tilorone dans ce test. Le traitement à la tilorone de 10 µM a entraîné une survie clonogénique de 40 % dans les cellules PC3 CDK5dn et de 72 % dans les cellules témoins PC3 (p = 0,002).

Un test de croissance sphéroïde a été réalisé pour évaluer la croissance 3dtumorale et l’invasion des cellules PC3 lors du traitement à la tilorone (Fig. 4). Les cellules de contrôle PC3 et PC3CDK5dn ont toutes deux connu une augmentation comparable de la taille des sphéroïdes sur six jours. Cependant, la taille totale (la taille des sphéroïdes plus les germes) a augmenté plus fortement dans les cellules de contrôle PC3, confirmant que les cellules PC3 CDK5dn non traitées avaient un potentiel invasif diminué par rapport aux cellules de contrôle PC3. Lorsque la tilorone était administrée à 5 µm, les sphéroïdes témoins PC3 avaient une croissance et un motif invasif similaires aux cellules témoins PC3 non traitées (p = 0,59) (Fig. 4B, graphique de gauche). Cependant, lorsque la chlorone a été administrée à la même concentration aux cellules PC3 CDK5DN, une diminution significative de la taille des sphéroïdes et de la taille totale a été observée (p < 0,01), suggérant que la tilorone inhibe avec succès la croissance des sphéroïdes et l’invasion des cellules PC3 CDK5dn lorsqu’elles sont administrées à 5 µM (Fig. 4B, graphique de droite). À 10 µM, les deux lignées cellulaires isogènes avaient un potentiel invasif diminué.

Discussion

La JHDL, une bibliothèque de composés pharmaceutiques bien caractérisés, a été mise au point pour faciliter les études de valorisation des médicaments (29). La toxicité étendue in vivo et les profils pharmacocinétiques des composés dans la bibliothèque permettent un développement ultérieur rapide de ces composés. Plusieurs composés du JHDL ont été avancés dans des essais cliniques pour le cancer et d’autres applications thérapeutiques (13,14,16,17,30- 32–.

Dans la présente étude, nous avons examiné les composés JHDL qui inhibent différentiellement la croissance des cellules cancéreuses dans la présence d’inhibition de CDK5; la tilorone et un analogue de la tilorone ont été identifiés comme des agents ciblant sélectivement les cellules cancéreuses PC3 déficientes en CDK5. La tilorone (Amixine IC) est utilisée cliniquementdans certains pays comme agent antiviral actif par voie orale (25). La tilorone a été testée chez l’humainpour le traitement des gliomes cérébraux, de la papillomatose laryngée et du cancer du sein (28,33,34).Bien que l’efficacité antitumorale ait été rapportée, l’intérêt pour le traitement par le forcancancer à la tilorone s’est atténué. Récemment, Zhou et al ont rapporténouveaux analogues de tilorone avec une activité anticancéreuse améliorée (35). Ces analogues peuvent être prometteurs pour la toexamine, en particulier en association avec l’inhibition de CDK5.

En plus de la possibilité que la tilorone puisse être prometteuse en combinaison avec l’inhibition de CDK5, l’identification de la tilorone en tant qu’agent ciblant sélectivement les cellules au sein de CDK5 actif suggère des classes potentielles de médicaments pour potentialiser l’efficacité de l’inhibition de CDK5. La tilorone a été caractérisée comme un inducteur interféron (24). Cela suggère que l’interféron lui-même, ou un interféroninducteur alternatif tel qu’un agoniste TLR, peut être utile en association avec un inhibiteur de l’aCDK5. Néanmoins, d’autres mécanismes peuvent être impliqués. Par exemple, la tilorone est également un agent d’intercalation de l’ADN (24) et on peut envisager qu’elle peut moduler la structure de la chromatine et l’expression des gènes. D’autres fonctions de la tilorone, y compris la voie de signalisation et les interactions du facteur de transcription (36,37), peuvent également être impliquées. D’autres études sont nécessaires pour démêler le mécanisme d’action exact par lequel la tilorone cible sélectivement les cellules de cancer de la prostate CDK5-négatives.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier les professeurs P.J. Van Diestand E. Van der Wall pour leur soutien et leur discussion et leurs professeurs.A. Carducci et J.T. Isaacs pour leur fourniture de matériaux de laboratoire. Cette étude a été soutenue par l’Institut de recherche médicale des agents de bord, NCI R01 CA085567, R01 CA134767, DOD grantW81XWH-06-1-0139 et NCI SPORTIF subvention P50 CA58236. M.D.W. a été soutenu par le programme de bourses Dr Saal van Zwanenberg et HuygensScholarship.