Le séquençage N-terminal, souvent appelé séquençage d’Edman ou dégradation d’Edman, est une technique importante dans l’étude des protéines et reste une approche unique qui peut fournir de nouvelles données de séquence de protéines. C’est également la technique préférée pour la confirmation rapide de l’expression des protéines.
La chimie de cette approche a été introduite pour la première fois en 1950 par P. Edman de l’Université de Lund en Suède et développée au cours de ses travaux à Melbourne, en Australie, pour ce qui est considéré comme le premier dispositif de séquençage peptidique automatisé.
Chimie d’Edman
Figure 1. Chimie de dégradation d’Edman pour le séquençage des protéines N-terminales.
Les réactions chimiques qui conduisent à l’acide aminé marqué N-terminal hydrolisé sont représentées sur la figure 1. Chaque cycle comprend essentiellement 3 étapes:
- Couplage du phénylisothiocyanate (PITC, réactif D’edman) à l’alpha-amine de la chaîne polypeptidique dans des conditions basiques pour former un fragment phénylthiocarbamyle (PTC).
- Le clivage dans des conditions acides douces génère une extrémité aminée libre sur le polypeptide et un acide aminé adduit à l’anilinothiazolinone (ATZ).
- Ce dernier est extrait et converti en un dérivé de phénylthiohydantoïne (PTH) plus stable.
Le résidu PTH résultant est analysé par HPLC et temps de rétention par rapport à celui des acides aminés PTH standards.
Réactions secondaires et sous-produits
La chimie du cycle de séquençage et le travail sont bien contrôlés et donnent des espèces parfaitement définies, quelques sous-produits sont détectés lors de l’analyse.
Comme le montre la figure 2, ils proviennent principalement de l’hydrolyse et de la méthanolyse du PITC au cours du cycle et comprennent la diphénylthiourée (DPTU), le N-phényle, l’O-méthylthiocarbonate (PMTC) et la diphénylurée (DPU), sous-produits qui co-extraient et co-éluent avec les acides aminés PTH.
