Mito-nukleáris introgressziós vonalak építése
kísérleteink mitonukleáris introgressziós vonalakon (MNILs) alapultak. Az építőiparban a MNILs részletesen ismertetjük Kurbalija Novicic et al. . Röviden, Az összes felhasznált Mnil-t izofemale vonalakból (IFL-ekből) hozták létre, amelyek mindegyikét egyetlen vadon gyűjtött párosított nőstény alapította, amely egy közös természetes populációból származik (Sicevo-szurdok-Szerbia, S 43 69’55,58″ N 22 0837,98″). A vonalakat először restrikciós enzimekkel genotipizálták mtDNS haplotípusukra, és hat IFL-t választottunk ki, amelyek közül három Hi haplotípust és három HII haplotípust hordozott, amelyek mindegyikét egy közös hetedik IFL-lel (“D”) kereszteztük. Minden egyes MNIL-ben a backcrossing-t úgy hajtottuk végre, hogy párosítottunk 10 Szűz nőstényt egy adott IFL-ből 20 hímmel a D vonalból. Ezt az ismételt introgresszív backcrossing eljárást alkalmaztuk 12 következő generáció számára egy adott IFL nukleáris genomjának helyettesítésére a közös tenyésztett d nukleáris genommal (> 99,95% helyettesítve). Vegye figyelembe, hogy az IFL – ek nem voltak beltenyésztettek vagy más módon izogének. Az introgresszió során a szennyeződés lehetőségének kizárása érdekében az összes Mnil mtDNS integritását az 5., 8. és 12. generációban validálták úgy, hogy minden MNIL-ből egy legymintát genotipizáltak. Megvizsgáltuk a Wolbachia jelenlétét is az összes Mnil-ben, PCR-vizsgálattal 16S rDNS Wolbachia-specifikus primerek alkalmazásával, a Garc-ban részletezett módszerekkel. . Két különböző Wolbachiát tartalmazó Drosophila törzset használtunk pozitív kontrollként (D. melanogaster 5. számú állomány, Bloomington Stock Center, D. simulans, Riverside törzs). Ezek a PCR-vizsgálatok negatívak voltak az összes Mnil-re, valamint a D-vonalra. Minden vonalat fenntartottunk, és minden kísérletet állandó laboratóriumi körülmények között végeztünk, 19 60% – os relatív páratartalom mellett, 300 lx fényben és 12 órás fény: 12 órás sötét fényperiódusban.
a kísérleti evolúciós populációk megalapítása
a kísérleteket megelőzően egyesítettük a HI-t hordozó három Mnil-t egy HI-forrás populációba, a három HII-Mnil-t pedig egy HII-forrás populációba, hogy homogenizáljuk a potenciális nukleáris genetikai variációt az Mnil-ek között. Ez úgy történt, hogy minden MNIL-ből 100 felnőtt legyet kevertek két populációs ketrecben (azaz., N = 3 600 legyek ketrecenként) (plexi ketrecek, L25 cm x W15 cm xH15 cm, 3 edényben, amelyek mindegyike 30 ml kukoricalisztet tartalmaz), és ezeket egy következő teljes generációra fenntartják standard laboratóriumi körülmények között. A két forráspopuláció tehát vagy a HI vagy a HII mtDNS haplotípust hordozta, amelyet egy kültenyésztett és közös nukleáris genetikai háttér (azaz D) fejez ki. A két forráspopulációból származó Szűz legyeket ezután nemesítették, és felhasználták a kísérleti evolúciós populációk megtalálására.
n = 12 kísérleti evolúciós populációt indítottunk. Minden populációban N = 100 szűz legyet (nemi arány 1:1) 3-5 napos korban vezettek be a forráspopulációkból egy populációs ketrecbe (L25 cm x W15 cm xH15 cm). A HI és HII haplotípusok és az élelmiszer-erőforrás-feltételek kiindulási gyakoriságát populációkon belül változtattuk, egy 2 db-os (n = 3 populáció sejtenként) keresztezett kialakítással, a következő módon. A ketrecek felében az alapító legyek 80% – a A HI-forrás populációból, 20% – a pedig a HII-forrás populációból származott. A másik felében az alapító legyek 20% – a A HI-forrás populációból, 80% – a pedig a HII-forrás populációból származott. Az élelmiszer-erőforrás feltételeit tekintve a közeg mennyisége (mind térfogat, mind felület szerint) azonos volt a két kezelési csoportban, míg a populáción belül a tápanyag-koncentráció változása az alábbiak szerint manipulált. A ketrecek fele (homogén táplálékfeltételek) 3 azonos ételt tartalmazott, mindegyik 30 ml standard kukoricadara táptalajt (YC) tartalmazott, amely 1,5% élesztőt tartalmazott. A ketrecek másik fele (heterogén táplálékfeltételek) szintén 3 edényt tartalmazott, mindegyik 30 ml standard táptalajjal, de ezek élesztő koncentrációban különböztek (il-0,375%, YC – 1,5%, YH – 6%).
a kísérleti evolúciós populációk fenntartása
a populációkat a laboratóriumban olyan módon tartottuk fenn, hogy biztosítsák a diszkrét generációkat , 40 nap/ciklus, 19cc, 60% relatív páratartalom és 12 óra fény: 12 óra sötét ciklus. A 40. napon a három régi ételt három új váltotta fel, a legyeket pedig összesen 9 napig engedték ovipozícióra . Az új edényeket, amelyek tojásokat és lárvákat tartalmaztak, megtisztították a felnőttektől, és áthelyezték egy új ketrecbe, hogy elindítsák a következő generációt. Minden felnőtt legyet minden régi ketrecben megszámoltak, miután meghaltak.
szekvenálás és mitogenom összeállítások
a haplotípus gyakoriságának becslését (lásd alább) megelőzően szekvenáltuk és összeállítottuk az összes felhasznált mtDNS haplotípust. DNS-t extraháltunk a hat IF vonalból (HI: 1, 3, 5; HII: 21, 25, 29), amelyet az MNILs létrehozásához használtak, só-etanol kicsapási protokoll alkalmazásával. A legyeket először óvatosan maceráltuk, és preparációs pufferbe (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH = 8,0, 0,5% SDS) helyeztük a proteináz K-val együtt, vortexeltük és 50 oc-on inkubáltuk egy éjszakán át. A mintákat egy éjszakán át fagyasztottuk. A DNS kicsapásához telített NaCl-t adtunk hozzá többször, mielőtt 95% – os etanolt adtunk hozzá, és a DNS-t pelletbe forgattuk. A DNS-pelletet te 4 pufferben szuszpendáltuk (pH = 7,6). A DNS minőségét és mennyiségét NanoDrop, Qubit és Bioanalyzer alkalmazásával értékelték, majd a fragmentum hosszának értékelését agaróz gélen végezték.
szekvenáló könyvtárakat készítettünk 100 ng DNS-ből a TruSeq PCRFREE DNS könyvtár előkészítő készlet. A hat mintát ezután 125 bp-re szekvenáltuk párosított végű olvasmányok két sávban egy Illumina HiSeq2500 rendszeren v4 szekvenáló kémia segítségével. Összesen átlagosan 194 millió olvasást szekvenáltunk könyvtáranként. A hat mintából származó mitogenomokat ezután az egyes könyvtárakból származó összes olvasás 5% – os részhalmazának felhasználásával állítottuk össze. Az olvasásokat a MITObim V 1.8 algoritmusba és a MIRA V 4.0-ba táplálták.2 assembler, irányított szerelvények végrehajtására, a Drosophila pseudoobscura mitogenom (GenBank: FJ899745.1) referencia genomként. Az összes kapott szerelvény kör alakú mitogenom volt, majdnem 16kbp méretű. A végső szerelvényeket ezután a ClustalW és a MAFFT segítségével igazították, és manuálisan kurálták, hogy minden haplotípushoz végső csiszolt szerelvényt kapjanak. Az összeszerelt mitogenomokat dogmákkal és mitókkal jegyezték fel , az alapértelmezett paraméterbeállításokat használva, és végül manuálisan kurálták.
mitogenom-összeállításunk érvényességének értékeléséhez a Genbankon elérhető összes Drosophila subobscura mtDNS szekvenciát (Cox1, Cox2, Cox3, Cob, Nad1, Nad2, Nad3, Nad5, rrnL, rrnS, az A + T gazdag régió és számos tRNS), amelyek összesen a teljes összeállítás több mint 50% – át fedik le, igazítottuk mitogenomjainkhoz. Kivétel nélkül ezek > 99% – os szekvenciaazonosságot mutattak.
számos egyedi SNP-t találtak a hat mitogenom haplotípus mindegyikében (lásd alább), amelyek közül kettő következetesen megkülönböztette a HI és HII haplotípus csoportokat. Az egyes SNP-k lefedettségi mélységét úgy ellenőriztük, hogy leképeztük a Mitogenom összeállításhoz használt olvasmányokat a Bowtie v 1.2 segítségével . Ezek az erőfeszítések megerősítették az összeszerelési lépésben azonosított összes SNP-t. Itt az I. és II. haplotípus két fő csoportjára összpontosítunk, amelyek a populáción belüli polimorfizmus feltűnő és következetes mintázatát mutatják a populációk között (ábra. 1) és funkcionális fenotípusos különbségek (lásd Bevezetés). Bár az SNP-k mind a két haplotípus-csoportban előfordulnak, az ilyen SNP-k ritkák (például), és nem következetesen polimorfak.
az mtDNS haplotípus gyakoriságának becslése
pool-seq-t használtunk a haplotípus gyakoriságának evolúciójának becsléséhez, minden kísérleti evolúciós populáció 5.és 10. generációjából származó legyek mintáinak szekvenálásával. Mindegyik mintában ketrecenként 105 véletlenszerűen kiválasztott legyet gyűjtöttek össze, és DNS-extrakciónak vetették alá (15 fős csoportokban), valamint szekvenáló könyvtárkészítményeknek vetették alá a fent leírtak szerint. Az N = 24 mintát ezután 125 bp-re szekvenáltuk párosított végű olvasmányok két sávban egy Illumina HiSeq2500 rendszeren, V4 szekvenáló kémia alkalmazásával. Pool-seq erőfeszítéseinket úgy terveztük, hogy elegendő szekvenálási mélységet biztosítsunk az mtDNS haplotípus frekvenciáinak pontos becsléséhez, de nem teszi lehetővé a nukleáris Genom részletes elemzését.
könyvtáranként átlagosan 66 millió olvasást szekvenáltunk. Az egyes könyvtárakból származó olvasmányokat ezután leképezték a hat összeszerelt mitogenómra, csak egyedi és nulla eltérésű leképezéseket tartva meg a Bowtie v 1.2 használatával . A HI és HII típusokat megkülönböztető két SNP-hez (Nad5 és 12S rRNS) leképezett olvasások számát ezután megszámoltuk, és az egyes mintákban az egyes fő haplotípusok (HI vagy HII) relatív gyakoriságának becsléseként használtuk.
statisztikai elemzések
minden minta esetében a két diagnosztikai SNP-hez (lásd alább) leképezett összes olvasatot HI vagy hii típusúnak számítottuk. A HI-értékek aránya a két különböző SNP esetében nagyon szorosan korrelált a 24 mintában (r = 0,987), így mindkét marker gyakorlatilag azonos becsléseket adott. Itt, itt mindkét SNP átlagos arányát használtuk, hogy megbecsüljük az egyes pool-seq mintákban jelen lévő HI gyakoriságát.
az evolúció meghatározható a genotípus gyakoriságának változásaként egy populáción belül, és kialakításunk lehetővé tette számunkra, hogy az egyes fejlődő vonalainkban generációnkénti haplotípus frekvenciaváltozások két időben elválasztott, ismétlődő mértékét levezetjük, amelyek vagy a következők lehetnek: 6-0-5 = (f5–f0)/5 vagy 5-10-10 = (f10 – f5)/5, ahol az előfizetések azt a generációt jelölik, amelyen a mintát gyűjtötték. Ezen felül a nettó haplotípus frekvenciaváltozásának felmérésére becsültük meg a 6-10 = (f10–f0)/10 értéket. Mivel csak két genotípus volt érintett, a hi: fI = 1 – fII gyakorisága, ezért elemzéseinket az egyik haplotípus gyakoriságának változására korlátozzuk. Minden egyes becsléshez a haplotípus frekvenciáinak megfigyelt változásához szükséges szelekciós erősségnek megfelelő frekvenciafüggő szelekciós együtthatót (SI) is levezetünk (lásd alább).
minden fejlődő vonal egy megfigyelési egységet képvisel a tervezésünkben, ezért elemeztük adatainkat ismételt mérésekkel Anovák (azaz alanyon belüli Anovák). Itt minden sor az alanyt jelöli, és a HI (0,2 vagy 0,8) és a környezeti állapot (homogén vagy heterogén) kezdő gyakorisága két alany közötti tényező volt, és a különböző generációs intervallumokban végzett két ismételt mérést (a). Ezekben az elemzésekben az alanyok közötti fókusz faktorok tesztelik kísérleti kezeléseink hatásait, az alanyokon belüli faktorok pedig azt tesztelik, hogy az evolúció mintázata megváltozott-e kísérletünk során. Ez az analitikai stratégia arra a tényre támaszkodik, hogy a frekvenciadinamikát replikált és független vonalakban követjük nyomon, valamint a véletlenszerű genetikai sodródás nem fokális hatása, amely várhatóan jelentős lesz az mtDNS dinamikája szempontjából, részét képezi következtetési modelljeink maradék idejének. Az alanyok közötti tényezők hagyományos F-tesztjeit permutációs tesztekkel validáltuk, az adatok 9999 véletlenszerű permutációja alapján. A különböző csoportok átlagos SI-értékét 95% – os CI-k felhasználásával értékelték 9999 bootstrap adatmásolatokból.
a frekvenciafüggő szelekció erősségének becslései
azt is kívántuk pontosabban felmérni, hogy a frekvenciafüggő szelekció erőssége a HI-n és a HII-n különbözött-e a két környezeti kísérleti kezelés között (homogén / heterogén). Ennek lehetővé tétele érdekében empirikus adatainkból egyszerű frekvenciafüggő szelekciót vezettünk le a következő indoklás felhasználásával. A nem kísérleti adatok korábbi explicit modellezése ebben a rendszerben azt mutatta, hogy a legjobban illeszkedik a haplotípus frekvencia dinamikus adataihoz, ahol nincs pozitív vagy negatív szelekció ezeken az mtDNS haplotípusokon, de ahol van negatív frekvenciafüggő szelekció, amely mindkét haplotípuson egyformán erős . Figyelembe vesszük a HI és HII két mtDNS haplotípust, a Pi és pII (pI + pII = 1), valamint a Wi és WII frekvenciákat. A PI generációnkénti változását ezután adja meg
$$ \Delta {p}_I= \ frac{p_I{p} _ {II} \ balra ({W}_I – {W} _ {II} \ jobbra)} {\overline{W}} $$
megfigyelések mindkét természetes populációból (Lásd az ábrát. 1; További fájl 1) és a replikált laboratóriumi ketrecpopulációk azt is sugallják, hogy a szelekció szimmetrikus és egyensúlyi a két HI és HII haplotípus esetében a pI = pII = 0,5 közelében. Feltételezve (i) A pI = pII = 0 egyensúlyi frekvenciáját.5, (ii) hogy a haplotípus alkalmassága lineárisan kapcsolódik a haplotípus gyakoriságához és (iii) hogy a szelekció szimmetrikus, amelyek mindegyikét korábbi tanulmányok támasztják alá, elérjük
$$ {W}_I=1 – {p}_I{s}_I $$
$$ {W} _ {II} = 1 – {p} _ {II}{s}_I $$
ahol sI a frekvenciafüggő szelekciós együttható. Tekintettel arra, hogy a \( \overline{W}={p}_I{W}_I+{p}_{II}{W}_{II} \) tudunk majd a becslés sI a mi empirikus megfigyelések ΔpI, mint
$$ {s}_I=\frac{-\Delta {p}_I{p}_I-\Delta {p}_I{p}_{II}}{-\Delta {p}_I{p_{II}}^2-{p_I{p}_{II}}^2+{p_I}^2{p}_{II}-\Delta {p}_I{p_I}^2} $$
Meghatározott így, sI feltételezi, hogy egy tetszőleges skála, de az pozitív, ha a ΔpI változások felé a attractor pedig negatív, akkor a változások távol a attractor. Minden ketrec esetében megbecsültük az sI két független ismételt mérését a megfigyelt haplotípus gyakorisági változások alapján a 0-5, illetve az 5-10 generációk között. Megjegyezzük, hogy mérésünk pontos lesz, ha a valódi egyensúly közel van pI = pII = 0,5 de közelítőbb, ha a valódi egyensúly eltér ettől a feltételtől.
