absztrakt
Influenza vírus a neuraminidáz (NA) az intracelluláris vírusreplikációs ciklust követően alapvető szerepet játszik az utódok virionok felszabadulásában és terjedésében. Annak tesztelésére, hogy az NA elősegítheti-e a vírus bejutását a sejtekbe, humán légúti epithelium tenyészeteket fertőztünk meg humán és madárinfluenza vírusokkal a na inhibitor oszeltamivir-karboxilát jelenlétében. Húsz-500-szor kevesebb sejt fertőződött meg a gyógyszerrel kezelt, mint a nem kezelt tenyészetekben (P < 0,0001) 7 órával a vírus alkalmazása után, jelezve, hogy a gyógyszer elnyomta a fertőzés megkezdését. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a vírus NA szerepet játszik a fertőzés korai szakaszában, és további indoklást nyújtanak a na inhibitorok profilaktikus alkalmazására.
úgy gondolják, hogy a virális neuraminidáz (NA) fő funkciója a fertőzés végső szakaszában van, amikor az NA lebontja a sziálsavat a sejtfelszínről és az utód virionokat, megkönnyítve a vírus felszabadulását a fertőzött sejtekből (1, 2). Kevésbé ismert az NA funkciókról a vírus sejtbe jutása során. Régóta feltételezik, hogy az NA elősegíti a vírus hozzáférését a légutak célsejtjeihez a nyálka lebomlásával (3). Ezt a koncepciót azonban soha nem bizonyították hivatalosan a megfelelő kísérleti rendszer hiánya miatt. Ezenkívül beszámoltak néhány bizonyítékról, amely a NA szerepe ellen szól a fertőzés korai szakaszában (áttekintve a 2. hivatkozásban).
ennek a kérdésnek a kezelésére tanulmányoztuk az NA inhibitor oseltamivir-karboxilát (OC) (9) hatását az influenzavírus bejutására az emberi légúti hám kultúrájába. Az elsődleges humán tracheobronchialis hámsejteket (HTBE; Clonetics) és az elsődleges orrhámsejteket (PromoCell GmbH) membrán hordozókon (12 mm Transwell-Clear; Corning, Inc.) a levegő-folyadék határfelületen szérummentes növekedési Faktorban és hormonpótló táptalajban (6, 8). Minden kísérlethez teljesen differenciált 4-8 hetes kultúrákat használtunk. Ezek a tenyészetek pszeudostratifikáltak és polarizáltak voltak; bazális, csillós és nyálka-szekretáló sejteket tartalmaztak; és nagyon hasonlítottak az emberi légúti epitheliumra in vivo (ábra. 1). OC-t (ha másképp nincs feltüntetve) (1 db) adtak a tenyészetek vírusszuszpenzióihoz és bazolaterális rekeszeihez röviddel azelőtt, hogy apikális oldalról két párhuzamos tenyészetet megfertőztek volna. Két kontroll tenyészetet fertőztünk meg inhibitor hiányában. Egy órával a fertőzés után eltávolítottuk a vírus inokulumát és inkubáltuk a tenyészeteket a levegő-folyadék határfelületen további 6 órán keresztül, hogy lehetővé tegyük az intracelluláris vírus replikációját. A tenyészeteket ezután rögzítették, és a fertőzött sejteket poliklonális antiszérumokkal egész vírusokká festették, majd a megfelelő peroxidázzal jelölt másodlagos antitesteket (Dianova) és aminoetilkarbazol szubsztrátot (Sigma). A pozitív festés a vírus sikeres bejutását jelezte a sejtbe. A tenyészeteket analizáltuk en arc nagyítással 600 (Olympus IMT-2). A vírusantigént expresszáló sejtek teljes számát megszámoltuk az epitheliális szegmensben, amely magában foglalta az összes egymást követő mikroszkopikus nézetet (0,28 x 0,42 mm) a tenyészet átmérője mentén (szegmensfelület, 3 mm2; sejtek száma szegmensenként, körülbelül 30 000). Tenyészetenként négy szegmenst számoltunk úgy, hogy a tenyészetet az óramutató járásával megegyező irányban 45o-val forgattuk. két párhuzamos tenyészet nyolc szegmensének adatait átlagoltuk.
két HTBE tenyészetet használó kísérletben az a/Memphis/14/96 (H1N1) humán vírus 22 – szer kevesebb sejtet fertőzött meg NA inhibitor jelenlétében, mint a kontrollok (ábra. 2; 1. TÁBLÁZAT) (P < 0,0001). A vadon élő vízimadarakból származó a/Duck/Alberta/119/98 (H1N1) és a házi baromfiból származó a/Turkey/Italy/2379/99 (H7N1) vírusok szintén jelentősen érzékenyek voltak az OC-ra ezekben a tenyészetekben. Nazális epitheliális tenyészetekben az OC 120 – szor, illetve 520-szor csökkentette a humán vírusfertőzést. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a vírus NA gátlása elnyomja a vírusfertőzés megkezdését.
az A/Chicken/Germany/R28/03 (H7N7) a magas patogenitású madárinfluenza víruscsaládhoz tartozik, amely 2003-ban a holland, belga és németországi kereskedelmi baromfitenyésztő gazdaságokban szárnyaspestist okozott. Ezek a vírusok legalább 89 emberre terjedtek, akiknek többsége kötőhártya-gyulladással járt, de egy halálos kimenetelű tüdőgyulladás is előfordult (5). A H7N7 csirkevírus fertőzés HTBE tenyészetekben 140 – szeresére, illetve 40-szeresére csökkent 1, illetve 0,1 MHz oc jelenlétében. Ezek a koncentrációk a gyógyszer tipikus maximális és minimális plazmakoncentrációját jelentették, amelyet emberben 75 mg oszeltamivir-foszfát, a profilaxis ajánlott dózisának beadása után értek el (9).
annak a hipotézisnek a megerősítésére, hogy a fertőzés gátlása kísérleteinkben közvetlenül összefügg a vírus NA enzimatikus aktivitásának gátlásával, humán a/Sydney-t használtunk/5/97-mint a vírus (H3N2) és oszeltamivir-rezisztens mutánsa R292K szubsztitúcióval az NA-ban, ami 9000-szer kevésbé érzékeny az OC (4) gátlására. A hipotézissel összhangban az OC erősen gátolta a szülő humán vírust, míg a rezisztens mutáns gátlásának csak marginális szintjét figyelték meg, amikor mindkét vírust ugyanabban a kísérletben tesztelték HTBE tenyészetekben (1.táblázat). Eddig nem állt rendelkezésre megfelelő sejttenyésztési vizsgálat az influenza vírus na-gátlókkal szembeni rezisztenciájának monitorozására, mivel az emberekben és a hagyományos laboratóriumi sejtvonalakban a sziálsav receptorok nem felelnek meg (9, 11). Eredményeink arra utalnak, hogy az emberi légúti hám differenciált kultúrái megfelelő sejttenyésztési rendszer lehetnek az influenza vírus na-gátlókkal szembeni rezisztenciájának kimutatására.
végül, a gyógyszer-érzékeny a / Sydney/5/97-mint a vírus, teszteltük a fertőzés gátlását OC-vel, amelyet a vírus beoltása után különböző időpontokban adtak hozzá. Míg 47-szer kevesebb sejt fertőződött meg, amikor a gyógyszert röviddel a fertőzés előtt adták hozzá, az OC hozzáadásával járó 1-h késleltetés csak 1,5-szeres gátlást eredményezett a nem kezelt kontrollhoz képest (1.táblázat). Ha a hatóanyagot 4 órával a vírus beoltása után adtuk hozzá, statisztikailag szignifikáns gátlást nem figyeltek meg. Ezek az adatok arra utaltak, hogy az OC befolyásolta a vírus replikációját megelőző fertőzés legkorábbi szakaszait.
összefoglalva, itt először nyújtottunk közvetlen kísérleti bizonyítékot az NA alapvető szerepére az emberi légutak csillós hámjának vírusinváziójának szakaszában. Az NA funkció ebben a szakaszban nagy valószínűséggel a csali receptorok eltávolítása a mucinokon, a csillókon és a celluláris glycocalixon, amelyek erős kötődése mindegyikhez akadályozná a vírus hozzáférését a célsejtek felszíni membránján lévő funkcionális receptorokhoz. Azonban más NA funkciók—például a hemagglutinin által közvetített fúzió előmozdítása (7) – nem zárhatók ki, és további vizsgálatokra van szükség annak pontos meghatározásához mechanizmusok, amelyekkel az NA elősegíti a vírus bejutását a légúti hámsejtekbe.
mivel a magas patogenitású H7N7 és H5N1 madárinfluenza-vírusok ellen még nem áll rendelkezésre vakcina, a vírusellenes gyógyszerek továbbra is az egyetlen lehetőség a madárinfluenza elleni küzdelemre (10). Más influenzaellenes szerekkel összehasonlítva a NA-inhibitorok jól toleráltak és hatásosak az influenza A és B vírusok valamennyi törzsével szemben. Kevés bizonyíték van a vírusrezisztencia kialakulására, és a mutáns vírusok fertőzőképessége általában veszélybe kerül (9, 11). A NA-gátlók azon képessége, hogy elnyomják a fertőzést, mielőtt a vírus bejutna a sejtekbe, hangsúlyozza a megelőző intézkedések magas potenciálját. Adataink különösen tudományos alapot nyújtanak ezen vegyületek profilaktikus alkalmazásának alátámasztására a madárinfluenza-vírussal való fertőzés magas kockázatának kitett személyek esetében.
