a TUNEL assay-t leggyakrabban az apoptózison átesett sejtek kimutatására használják, ami a programozott sejthalál egyik formája. Az apoptózis fontos biológiai folyamat a fejlődés során, valamint a szövetek homeosztázisának fenntartásához. A TUNEL festés lehetővé teszi az apoptotikus sejtek vizualizációját és számszerűsítését. Ez segít a tudósoknak az új kezelések hatékonyságának tesztelésében olyan rendellenességek esetén, amelyekben az apoptózis vagy gátolt, mint a rákban, vagy fokozott, mint a neurodegenerációban.
ez a videó elmagyarázza, hogyan lehet A TUNEL-vizsgálatot használni az apoptózison átesett sejtek címkézésére, amely lépésről lépésre protokoll a módszer szöveti szakaszokban történő végrehajtására, és hogyan alkalmazzák a kutatók ezt a technikát a sejthalál mechanizmusainak megértésére.
mielőtt elmélyülnénk a TUNEL-vizsgálat protokolljában, beszéljük meg ennek a technikának az alapelveit.
az apoptózis számos jellemző jellemzője a DNS fragmentációja. Hogyan történik a DNS fragmentáció? Az apoptózist a citoszolban jelen lévő kaszpázoknak nevezett enzimek végzik. Elsődleges szerepük a fehérjék hasítása a sejt lebontása érdekében. Ezenkívül a kaszpázok aktiválják a kaszpáz-aktivált DNáz vagy CAD nevű enzimet azáltal, hogy leválasztják inhibitoráról—ICAD. Az aktivált CAD egy endonukleáz, amely eljut a sejtmagba és hasítja a kromoszómális DNS-t.
a DNS hasítása végső soron a megrepedt végű DNS-fragmensek felhalmozódását okozza, és a TUNEL-vizsgálat fluoreszcens módon megjelöli a fragmentált DNS ezen megrepedt végeit, lehetővé téve a tudósok számára az apoptózis kimutatását. De hogyan történik ez? Ehhez meg kell értenie a TUNEL reakcióját. A TUNEL a terminális dezoxinukleotidil-transzferáz által közvetített dUTP nick-end címkézést jelenti. A két fő TUNEL reagens a terminális dezoxinukleotidil-transzferáz vagy TdT, valamint a dezoxiuridin-trifoszfát vagy dUTP, amelyek fluoreszcens módon jelölhetők a kimutatás megkönnyítése érdekében.
a TUNEL-reakció megértése érdekében térjünk vissza az apoptotikus sejtekhez DNS-fragmensekkel. Ezeknek a bemetszett fragmenseknek szabad 3 ‘ hidroxilcsoportjai vannak. Miután hozzáadta a TUNEL reagenseket egy apoptotikus sejteket tartalmazó mintához, a fluoreszcensen jelölt dutp-k ezekhez a 3’ – hidroxilcsoportokhoz kapcsolódnak a TDT katalizátor enzim segítségével. Az ezzel az eljárással festett sejteket TUNEL-pozitív sejteknek nevezzük, amelyeket fluoreszcens mikroszkópiával lehet vizualizálni.
most, hogy megértette a TUNEL-vizsgálat mögött meghúzódó alapelveket és fogalmakat, vázoljunk fel egy általános protokollt ennek a technikának a szövetszakaszokban történő végrehajtására. A TUNEL-vizsgálat fő lépései közé tartozik a kívánt szövet rögzítése, a szövet permeabilizálása, TUNEL-reagensek hozzáadása, a TUNEL-reakció leállítása, végül az elemzés.
először a biológiai struktúrák megőrzése érdekében rögzíteni kell a kérdéses szövetet. A rögzítés úgy működik, hogy térhálósítja a fehérjéket a sejtekben. A TUNEL vizsgálathoz a szöveteket úgy lehet rögzíteni, hogy 4% paraformaldehidet tartalmazó oldathoz adjuk 4-24 órán át 4 6CC-n.a rögzítés után a szövetet 10 mm-es vagy annál kisebb vékony szeletekre krioszekcionáljuk.
a következő lépés a permeabilizáció, amely lehetővé teszi a reagensek, például a TdT enzim behatolását a sejtmagba. A szövetszakaszok permeabilizálását úgy hajthatjuk végre, hogy a szövetet a proteináz K oldathoz adjuk 5-15 percig 37 6c-n.a szövetszakaszokat foszfát-pufferolt sóoldattal öblítsük le orbitális rázógépen 15-30 percig szobahőmérsékleten.
a permeabilizációt követően a TDT enzimet és a fluoreszcens módon jelölt dutp-kat hozzáadjuk a szövetrészekhez, valamint egy kobaltot tartalmazó címkéző puffert, amely a TUNEL-reakció kofaktoraként működik. A TUNEL-reakcióelegyet és a szövetszakaszt együtt 1-3 órán át inkubáljuk 37 6CC-on, és fénytől védjük, hogy megakadályozzuk a fluoreszcencia elhalványulását.
inkubálást követően stop puffert adunk a szövetszakaszhoz a TUNEL-reakció leállításához, majd rövid inkubálás után a szakaszokat foszfátpufferelt sóoldattal mossuk. Végül a fluoreszcens módon megjelölt dUTP-vel festett szövetszakaszokat fluoreszcens mikroszkóppal vizualizáljuk, és értékeljük a TUNEL-pozitív sejtek lokalizációját egy adott szöveten belül. A sejthalált egyszerűen úgy lehet számszerűsíteni, hogy megszámoljuk a TUNEL-pozitív sejtek százalékát egy adott szövetszakaszban.
most, hogy látta, hogyan kell elvégezni a TUNEL vizsgálatot az apoptotikus sejtek kimutatására, beszéljük meg, hogyan lehet ezt a vizsgálatot felhasználni a sejtbiológusok által feltett kérdések megválaszolására.
a sejthalál a szövetek és struktúrák szobrászatának, valamint a felesleges sejtek eltávolításának normális részeként történik. Ezért a jelenség iránt érdeklődő tudósok tanulmányozzák a különböző anyagok prenatális expozíciójának hatását az apoptózisra a fejlődés során. Itt a tudósok érdeklődtek a prenatális alkohol expozíciónak az agy fejlődésére gyakorolt hatásának vizsgálatában. A magzati agyon végzett TUNELFESTÉS eredményei fokozott apoptózist tártak fel azokban a szövetekben, amelyek prenatálisan alkoholnak voltak kitéve, a kontrollállatokhoz képest.
a tudósok a TUNEL-vizsgálatot is használják az apoptózis vizsgálatára bakteriális fertőzésre adott válaszként. Ebben a kísérletben a tudósok kifejlesztették a tüdőgyulladás modelljét azáltal, hogy egereket injektáltak Pseudomonas aeruginosa-val, amely tüdőgyulladást vált ki. Ezután a tüdőszövetet eltávolították, és TUNELFESTÉST végeztek az apoptózis vizsgálatára a bakteriális fertőzésre adott válaszként. Az eredmények azt mutatják, hogy az apoptotikus sejthalál nőtt a baktériumoknak kitett egerekben, összehasonlítva a kontroll állatokkal.
végül, a TUNEL festés alkalmazható humán tumormintákon, annak érdekében, hogy meghatározzák a tumor reakcióképességét a gyógyszerekre. Ebben a példában a tumormintákat emberi betegekből gyűjtötték be, és ex vivo tenyésztették. Ezután preklinikai gyógyszerekkel kezelték őket, és a TUNEL-vizsgálat segítségével értékelték a választ. A kapott adatok azt mutatják, hogy a 90 hősokk-fehérjét gátló gyógyszerrel történő kezelés jelentősen növeli az apoptózist a tumorszövetben.
éppen most nézte meg JoVE videóját a TUNEL-vizsgálat használatáról az apoptózison átesett sejtek kimutatására. Ez a videó áttekintette a TUNEL festés alapelveit, valamint egy lépésről-lépésre protokollt a Tunel vizsgálat elvégzésére szövetszakaszokon. Azt is megvizsgáltuk, hogy ez a módszer hogyan alkalmazható a programozott sejthalál megértésére a fejlődés és a betegség során. Mint mindig, köszönöm, hogy megnézted!
