az N-terminális szekvenálás, amelyet gyakran Edman szekvenálásnak vagy Edman degradációnak neveznek, fontos technika a fehérje vizsgálatban, és továbbra is egyedülálló megközelítés, amely új fehérjeszekvencia-adatokat eredményezhet. Ez az előnyben részesített technika a gyors fehérje expresszió megerősítéséhez is.
ennek a megközelítésnek a kémiáját először 1950-ben vezette be P. Edman a svédországi Lund Egyetemen, és az ausztráliai Melbourne-ben végzett munkája során továbbfejlesztette az első automatizált peptidszekvenáló eszköz.
Edman kémiája
1. ábra. Edman degradációs kémia az N-terminális fehérje szekvenálásához.
a hidrolizált n-terminállal jelölt aminosavat eredményező kémiai reakciókat az 1. ábra mutatja. Minden ciklus lényegében 3 lépést tartalmaz:
- a fenilizotiocianát (PITC, Edman reagens) összekapcsolása a polipeptidlánc alfa-aminjával bázikus körülmények között feniltiokarbamil (PTC) részt képezve.
- enyhe savas körülmények között történő hasítás szabad amino terminált hoz létre a polipeptiden és egy anilinotiazolinon (ATZ) adduktált aminosavat.
- ez utóbbit extraháljuk, majd stabilabb feniltiohydantoin (PTH) származékká alakítjuk.
a kapott PTH maradékot HPLC-vel és retenciós idővel elemezzük a standard PTH aminosavakéval összehasonlítva.
mellékreakciók és melléktermékek
a szekvenálási ciklus kémiája és működése jól szabályozott, és tökéletesen meghatározott fajokat eredményez, néhány melléktermék kimutatható az elemzés során.
amint a 2.ábra mutatja, ezek főként a ciklus alatti PITC hidrolízisből és metanolízisből származnak, és magukban foglalják a difenil-tiokarbonátot (DPTU), az N-fenilt, az O-metil-tiokarbonátot (PMTC) és a difenil-karbonátot (DPU), olyan melléktermékeket, amelyek PTH-aminosavakkal együtt extrahálnak és együtt eluálnak.
