EuroMAbNet: Európai monoklonális antitest hálózat

protokollok

Hibridóma termelés

a hibridoma egy hibrid sejtből származó sejtvonal, amely képes az antigén egy epitópjára specifikus monoklonális antitest kiválasztására tartósan tenyészetben. A hibrid sejtet immunizált állatból (általában egérből, patkányból vagy nyúlból) származó specifikus antitest-termelő B-sejt fúziójával állítják elő, amelynek élettartama véges, egy “halhatatlan” tenyésztett myeloma sejtvonal sejtjével (például egér NS-1 vagy NS-0).

egér hibrid sejt előállítása

a fúziós folyamat során a B-sejteket izolálják az egér lépéből, összekeverik az egér myeloma sejtvonalával, és a fúziót polietilénglikollal indukálják (PEG, lásd az I. függeléket). (A megfelelő myeloma vonalat akkor használják, ha más állatfajokból származó B-sejteket használnak). A kapott hibridomákat ezután Hipoxatint, Aminopterint, Timidint (HAT) tartalmazó szövettenyésztő táptalajban tenyésztjük, amely lépés megöli a nem fuzionált myeloma sejteket, amelyek kinövhetik a többi gyengébb hibridoma sejtet. A nem fuzionált B-sejtek osztódási képessége korlátozott, és a tenyészetben természetes módon elpusztulnak. Tíz nappal a fúziós folyamat után a tenyészet felülúszóját összegyűjtik, és megvizsgálják a kívánt antitest jelenlétét.

a sejtfúzió sematikus ábrázolása

szükséges berendezések

• steril környezetben, amelyben előkészíti és kezelni sejtek (lamináris áramlás vagy class II szekrény)
• inkubátor beállítása 37 6C, 5% CO2 és a páratartalom 95%
• egy fordított mikroszkóp
• egy 37 6864>
• vízfürdő, amely lehet helyezni a szekrény centrifuga kilengő rotorral
• steril boncoló műszerek-ideális esetben két készlet -, amelyek mindegyike két pár ollóból és csipeszből áll (egy ívelt és egy tompa végű).
• 75 ml Szövet Corning kultúra lombikok – Ref. 15430641
• 24 jól Falcon lemezek-Ref. 353047
• steril pipetták
• Pipettatöltő
• steril pasteur pipetták
• időzítő

közepes és egyéb reagensek (további részletekért lásd az A. függeléket)

• RPMI 1640 pufferolt bikarbonát, L-glutaminnal (Lonza Ref. BE12-702F)
• RPMI 1640 Hepes pufferolt, L-glutamin nélkül
• jó minőségű (tételesen tesztelt) magzati szarvasmarha szérum (Genycell Ref. GCS0101-500)
• Penicillin/sztreptomicin (Gibco Ref. 15070-063)
• Ultroser G (Pall Ref. 15950-017)
• HAT (Hipoxathin, Aminopterin, timidin) (Gibco Ref. 21060-017)
• PEG 1500 (Roche Ref. 10783641001)

mielőtt elkezdené (további részletekért lásd az A. függeléket)

• Készítsen 500 ml a
• Készítsen 500 ml közepes a+
• készítsen 100 ml közepes B
• készítsen 100 ml közepes C
• Készítsen 500 ml közepes d

a myeloma sejtek felolvasztása és növekedése

felolvasztjuk a myeloma sejtvonalat és közepes A-ban növekedünk. Használja a következő módszert a myeloma sejtvonal felolvasztására és tenyésztésére.

• vegye ki a myeloma sejtek fagyasztott injekciós üvegét az LN2 tárolóból.
• helyezze a cellákat egy 37 CAC-os vízfürdőbe.
• tartsa a fagyasztó injekciós üveg fedelét a víz felszíne felett, hogy csökkentse a szennyeződés esélyét.
• amikor a sejtek majdnem felolvadnak (csak egy kis darab jég marad), a szövettenyészet burkolatába kerülnek.
• 70% – os etanollal törölje le az injekciós üveg külsejét, és távolítsa el a tetejét.
• steril Pasteur pipettával óvatosan távolítsa el a sejtszuszpenziót.
• töltsük át a tartalmát egy 10 ml a táptalajt tartalmazó centrifugacsőbe (lásd A. függelék)
• a sejtszuszpenziót óvatosan forgassuk 300 g-on 5 percig.
• távolítsuk el a felülúszót, reszuszpendáljuk a sejteket 10 ml friss a közegben, és tegyük egy kis (25 cm2) lombikba.
• Vegyünk 1 ml szuszpenziót az eredeti lombikból, és adjunk hozzá egy másodikhoz 9 ml közepes a-T.Ez biztosítja, hogy ha az első lombikban a koncentráció túl magas, akkor rendelkezésre áll egy második (alacsonyabb) sejtkoncentráció.
• tegye a lombikokat a CO2 inkubátorba. Ne felejtse el kissé nyitva hagyni a lombik fedelét, hogy lehetővé tegye a gázcserét.

a fúziós folyamat

három nappal korábban – készítse elő a myeloma sejteket a fúzióhoz

a myeloma sejteknek exponenciális növekedési fázisban kell lenniük, amikor használja őket, és ehhez tapasztalat szükséges. Ha azonban két 75 cm2-es lombikot állít fel a myeloma sejtjeiből, egyet 1:40-es hígítással, egyet 1:60-as hígítással (lásd alább), 3 nappal a fúzió előtt az egyik lombiknak ideálisnak kell lennie a fúzió napján. (Kezdetben további lombikok felállítása az itt megadott hígítások felett és alatt biztosítja a szükséges tapasztalatokat a myeloma sejtek növekedési ütemének megítéléséhez a későbbi fúziókhoz).

egy nappal korábban – készítse elő a táptalajt

a következőket kell elkészíteni és előmelegíteni 37 CAC-ra (éjszakára beteheti az inkubátorba).

• két x 200 ml közepes a+ két 75 cm2-es lombikban
• 100 ml közepes B
• 100 ml közepes C
• 1×4 ml PEG 1500 fóliába csomagolva (Peg fényérzékeny) steril univerzális
• a mini vízfürdő, készült egy 200 ml-es főzőpohárba, amely körülbelül 100 ml desztillált vizet és keresztbe szalag elég széles ahhoz, hogy van egy nyílás, hogy tartsa egy 50 ml-es Falcon cső függőleges

nap a fúzió

• öld meg az egeret (követve intézményi iránymutatások), kivonat a lépet, és tedd egy steril tartályba, amely 5 ml közepes C.
• minden további lépést lamináris áramlású burkolatban kell végrehajtani.

• tegye a lépet és a közepét egy petri-csészébe.
• mozgassa a lépet steril csipesszel a mosáshoz. Távolítson el minden tapadást, és helyezze át a lépet egy második petri-csészébe
• vágja ketté a lépet. Tartsa az egyik felét tompa csipesszel és egy másik ívelt csipesszel, óvatosan ugrassa ki a sejteket a lépkapszulából, ügyelve arra, hogy a lehető legtöbb sejtet eltávolítsa. Ismételje meg a lép második felét
• távolítsa el a lépkapszula törmelékét, és steril Pasteur pipettával alaposan, de nagyon óvatosan keverje össze a sejteket.
• helyezze át a sejtszuszpenziót egy 15 ml-es csőbe, majd használjon további 5 ml közepes C-t a petri-csésze öblítéséhez, és adja hozzá a csőben lévő lépsejtekhez.
• számolja meg a myeloma és a lépsejteket.
• 1 myeloma sejt arányára van szükség minden 10 lépsejthez
• adja hozzá a myeloma sejteket egy 50 ml-es kúpos csőhöz.
• centrifugálja mind a lépsejteket (15 ml-es cső), mind a myeloma sejteket (50 ml-es cső) 300 g-on 10 percig.
• nagyon óvatosan öntse le mindkét cső felülúszóját, és óvatosan reszuszpendálja a pelleteket egyenként 10 ml B közegben. az FBS hiánya a fúziós folyamat befejezéséig rendkívül fontos, mivel a sejtek nem olvadnak össze, ha FBS van jelen)

• kombinálja a reszuszpendált lépsejtet és a myeloma pelletet egy 50 ml-es centrifugacsőbe.
• centrifugáljuk 5 percig 300 g-on.
• nagyon óvatosan öntse le a lehető legtöbb felülúszót.
• Reszuszpendálja a pelletet úgy, hogy finoman megérinti a csövet a padon. Ne pöccintse meg a pelletet vagy pipettázza, mert ez eloszlatja a sejteket a cső körül, csökkentve a fixáláshoz rendelkezésre álló sejtszámokat.
• helyezze a csövet a házi vízfürdőbe.
• adjunk hozzá 1,2 ml csapot cseppenként egy perc alatt, néhány cseppenként óvatosan kevergetve.
• adjunk hozzá 1 ml közepes B-t, cseppenként egy perc alatt, néhány cseppenként óvatosan kevergetve.
• adjunk hozzá további 2 ml B közeget, cseppenként két perc alatt, néhány cseppenként óvatosan kevergetve.
• adjunk hozzá további 4 ml B közeget, cseppenként négy perc alatt, néhány cseppenként óvatosan kevergetve.
• végén az idő, adjunk hozzá 8 ml közepes C.
• centrifugáljuk a csövet a sejtek 5 percig 300g.
• nagyon óvatosan dekantáljuk a felülúszó és reszuszpendáljuk a sejt pellet 1 percig 10 ml közepes a+. Ehhez adjunk hozzá néhány ml közeget, hogy elkezdjük a pelletet. Nagyon óvatosan szívja fel ezeket a sejtcsomókat, és mozgassa felfelé és lefelé a pipettában. Távolítsa el ezeket a sejteket, és ismételje meg a folyamatot. Legyen nagyon szelíd, ne erőltesse szét a pelletet, ha elkészült, kis sejtcsomók lehetnek. A sejtek ebben a szakaszban rendkívül törékenyek.
• tegye a 10 ml reszuszpendált fúziós keveréket 190 ml meleg közegbe a+
• a végső térfogat 200 ml
• tegyen 1 ml-t ebből a szuszpenzióból minden 8 x 24 kút (2 ml) lemez lyukába. (Összesen 192 kút)
• hagyja a lemezeket az inkubátorban egy éjszakán át (nagyjából 24 órán át).

a fúzió utáni nap

• adjon hozzá 8 ml kalapot 200 ml közepes A+ – hoz.
• tegyen 1 ml-t ebből a szelektív közegből a 8 lemez mindegyik kútjába.
• hagyja a lemezeket az inkubátorban. A telepek 7-10 nap között jelennek meg

I. függelék

táptalaj A:
RPMI 1640 táptalaj L-glutaminnal (bikarbonáttal pufferelt) (Lonza Ref. BE12-702F)
+ 10% FBS (Genycell Ref. GCS0101-500)
+ Penicillin (100 NE / ml)/sztreptomicin (100 mg / l) (Gibco Ref. 15070-063)

Táptalaj A+:
RPMI 1640 medium with L-Glutamine (bicarbonate buffered) (Lonza Ref. BE12-702F)
+10% FBS (Genycell Ref. GCS0101-500)
+ Penicillin (100U/ml)/Streptomycin (100mg/l) (Gibco Ref. 15070-063)
+ Ultroser G (1%) (Pall Ref. 15950-017)

Culture Medium B (no FBS):
RPMI 1640 Medium with L-Glutamine (Lonza Ref. BE12-702F)
+ Penicillin (100U/ml)/Streptomycin (100mg/l) (Gibco Ref. 15070-063)

Culture Medium C:
RPMI 1640 Medium with L-Glutamine (Lonza Ref. BE12-702F)
+ 10% FBS (Genycell Ref. GCS0101-500)
+ Penicillin (100U/ml)/Streptomycin (100mg/l) (Gibco Ref. 15070-063)

Culture Medium D:
RPMI 1640 medium with L-Glutamine (bicarbonate buffered) (Lonza Ref. BE12-702F)
+ 10% FBS (Genycell Ref. GCS0101-500)
+ Penicillin (100U/ml)/Streptomycin (100mg/l) (Gibco Ref. 15070-063)
+ Ultroser G (1%) (Pall Ref. 15950-017)
+ HAT (Hypoxathine, Aminopterin, Thymidine) supplement which is usually 50X (dilute 10ml in 500mls of medium) (Gibco Ref. 21060-017)