hirdetések:
ez a cikk rávilágít a fehérjetisztítás négy módszerére.
a fehérjetisztítás négy módszere a következő: (1) extrakciós (2) kicsapási és differenciális Szolubilizációs (3) Ultracentrifugációs és (4)kromatográfiás módszerek.
a fehérjetisztítás során alkalmazott módszerek nagyjából analitikai és preparatív módszerekre oszthatók.
hirdetések:
a megkülönböztetés NEM pontos, de a döntő tényező a fehérje mennyisége, amelyet ezzel a módszerrel gyakorlatilag meg lehet tisztítani. Az analitikai módszerek célja a keverékben lévő fehérje kimutatása és azonosítása, míg a preparatív módszerek célja nagy mennyiségű fehérje előállítása más célokra, például strukturális biológiai vagy ipari felhasználásra. Általában a preparatív módszerek alkalmazhatók analitikai alkalmazásokban, de nem fordítva.
1.módszer. Extrakció:
a fehérjeforrástól függően a fehérjét az azt tartalmazó szövet vagy sejtek törésével kell oldatba hozni. Számos módszer van ennek elérésére; ismételt fagyasztás és felolvasztás, szonikálás, homogenizálás nagy nyomáson vagy permeabilizáció szerves oldószerekkel. A választott módszer attól függ, hogy mennyire törékeny a fehérje és milyen erősek a sejtek.
ezen extrakciós folyamat után az oldható fehérje az oldószerben lesz, elválasztható a sejtmembránoktól, a DNS-től stb. centrifugálással. Az extrakciós eljárás kivonja a proteázokat is, amelyek megkezdik a fehérjék emésztését az oldatban. Ha a fehérje érzékeny a proteolízisre, általában kívánatos, hogy gyorsan haladjon, és a kivonatot lehűtse, hogy lelassítsa a proteolízist.
2.módszer. Kicsapódás és differenciális oldódás:
az ömlesztett fehérjetisztítás során a fehérjék izolálásának Általános első lépése az ammónium-szulfáttal (NH4)történő kicsapás 2so4. Ezt növekvő mennyiségű ammónium-szulfát hozzáadásával és a csapadékfehérje különböző frakcióinak összegyűjtésével végezzük. Ennek a módszernek az egyik előnye, hogy nagyon nagy mennyiségekkel olcsón elvégezhető.
hirdetések:
az első tisztítandó fehérjék a vízben oldódó fehérjék. Az integrált membránfehérjék tisztítása megköveteli a sejtmembrán megzavarását annak érdekében, hogy egy adott fehérjét elkülönítsünk másoktól, amelyek ugyanabban a membránrekeszben vannak. Néha először egy adott membránvonást lehet izolálni, például a mitokondriumok izolálását a sejtekből, mielőtt megtisztítanák a mitokondriális membránban található fehérjét.
detergens, például nátrium-dodecil-szulfát (SDS) használható a sejtmembránok feloldására és a membránfehérjék oldatban tartására a tisztítás során; mivel azonban az SDS denaturációt okoz, enyhébb detergensek, például Triton X-100 vagy CHAPS használhatók a fehérje natív konformációjának megőrzésére a tisztítás során.
3.módszer. Ultracentrifugálás:
A centrifugálás olyan eljárás, amely centrifugális erőt alkalmaz a folyadékban szuszpendált különböző tömegű vagy sűrűségű részecskék keverékeinek elválasztására. Amikor egy edény (általában egy cső vagy palack), amely fehérjék vagy más részecskék, például baktériumsejtek keverékét tartalmazza, nagy sebességgel forog, a szögimpulzus minden részecskének kifelé irányuló erőt ad, amely arányos a tömegével.
egy adott részecske hajlamát arra, hogy ezen erő miatt mozogjon a folyadékon, ellensúlyozza a folyadék által a részecskére kifejtett ellenállás. A minta centrifugában történő “forgatásának” nettó hatása az, hogy a masszív, kicsi és sűrű részecskék gyorsabban mozognak kifelé, mint a kevésbé masszív részecskék vagy a folyadékban “húzóbb” részecskék.
amikor a részecskék szuszpenzióit centrifugában “megpörgetik”, az edény alján “pellet” képződhet, amely a folyadékban alacsony ellenállású, legnagyobb tömegű részecskék számára dúsul. A fennmaradó, nem tömörített részecskéket, amelyek továbbra is többnyire a folyadékban maradnak, “felülúszónak” nevezzük, és eltávolíthatók az edényből, hogy elválasszák a felülúszót a pellettől.
a centrifugálás sebességét a mintára alkalmazott szöggyorsulás határozza meg, amelyet jellemzően a g. Ha a mintákat elég hosszú ideig centrifugáljuk, akkor az edényben lévő részecskék elérik az egyensúlyt, ahol a részecskék specifikusan az edény azon pontján halmozódnak fel, ahol felhajtóerő-sűrűségüket centrifugális erővel kiegyensúlyozzák. Egy ilyen “egyensúlyi” centrifugálás lehetővé teszi egy adott részecske kiterjedt tisztítását.
Szacharózgradiens centrifugálás:
a cukor (jellemzően szacharóz-glicerin vagy Percoll) lineáris koncentrációgradiense keletkezik egy csőben úgy, hogy a legmagasabb koncentráció az alján, a legalacsonyabb pedig a tetején van. Ezután egy fehérjemintát rétegeznek a gradiens tetejére, majd ultracentrifugában nagy sebességgel megpörgetik. Ez azt eredményezi, hogy a nehéz makromolekulák gyorsabban vándorolnak a cső alja felé, mint a könnyebb anyagok.
szacharóz nélküli centrifugálás során, amikor a részecskék egyre távolabb mozognak a forgás középpontjától, egyre nagyobb centrifugális erőt tapasztalnak (minél tovább mozognak, annál gyorsabban mozognak). A probléma ezzel az, hogy az edényen belüli hasznos elválasztási tartomány egy kis megfigyelhető ablakra korlátozódik.
hirdetések:
a minta kétszer olyan hosszú forgatása nem jelenti azt, hogy az érdekes részecske kétszer olyan messzire megy; valójában jelentősen tovább fog menni. Amikor azonban a fehérjék szacharóz gradiensen haladnak keresztül, egyre nagyobb sűrűségű és viszkozitású folyadékkal találkoznak.
egy megfelelően megtervezett szacharózgradiens ellensúlyozza a növekvő centrifugális erőt, így a részecskék szoros arányban mozognak a centrifugális mezőben töltött idővel. Az ezekkel a gradiensekkel elválasztott mintákat “sebességzónás” centrifugálásoknak nevezzük. A fehérje/részecskék elválasztása után a gradienst frakcionáljuk és összegyűjtjük.
4.módszer. Kromatográfiás módszerek:
hirdetések:
a fehérjetisztítási protokoll általában egy vagy több kromatográfiás lépést tartalmaz. A kromatográfia alapvető eljárása az, hogy a fehérjét tartalmazó oldatot különféle anyagokkal töltött oszlopon átfolyatják. A különböző fehérjék eltérően lépnek kölcsönhatásba az oszlop anyagával, így elválaszthatók az oszlop áthaladásához szükséges idővel vagy a fehérje eluálásához szükséges feltételekkel. A fehérjéket általában akkor detektálják, amikor az oszlopról 280 nm-es abszorbanciájukkal jönnek le.
hirdetések:
számos különböző kromatográfiás módszer létezik:
1. Méret kizárás kromatográfia:
a kromatográfiával porózus gélek alkalmazásával elválaszthatjuk a fehérjét oldatban vagy denaturálási körülmények között. Ezt a technikát méretkizárási kromatográfiának nevezik. Az elv az, hogy a kisebb molekuláknak nagyobb térfogatot kell áthaladniuk egy porózus mátrixban. Következésképpen egy bizonyos tartományú fehérjék változó térfogatú eluantot (oldószert) igényelnek, mielőtt a géloszlop másik végén összegyűjtenék őket.
a fehérjetisztítás összefüggésében az eluantot általában különböző kémcsövekben egyesítik. Minden kémcsövet, amely nem tartalmaz mérhető nyomot a fehérjéből a tisztításhoz, eldobjuk. A fennmaradó oldat így a fehérjéből készül, hogy megtisztítsa a többi hasonló méretű fehérjét.
2. Ioncserélő kromatográfia:
az ioncserélő kromatográfia az ionos töltésük jellege és mértéke szerint választja el a vegyületeket. A használni kívánt oszlopot a típus és a töltés erőssége szerint választják ki. Az anioncserélő gyanták pozitív töltéssel rendelkeznek, és a negatív töltésű com fontok megtartására és elválasztására szolgálnak, míg a kationcserélő gyanták negatív töltéssel rendelkeznek, és a pozitív töltésű molekulák elválasztására szolgálnak.
hirdetések:
az elválasztás megkezdése előtt puffert pumpálnak az oszlopon, hogy kiegyenlítsék az ellentétes töltésű ionokat. A minta befecskendezésekor az oldott anyagmolekulák cserélődnek a pufferionokkal, mivel mindegyik versenyez a gyanta kötőhelyeiért. Az egyes oldott anyagok visszatartásának hossza a töltés erősségétől függ.
először a leggyengébb töltésű vegyületek eluálódnak, majd azok, amelyek egymás után erősebb töltéssel rendelkeznek. Az elválasztó mechanizmus jellege miatt a pH, a puffer típusa, a pufferkoncentráció és a hőmérséklet mind fontos szerepet játszanak az elválasztás szabályozásában. Az ioncserélő kromatográfia nagyon hatékony eszköz a fehérjék tisztításához, és gyakran használják mind az analitikai, mind a preparatív szeparációkban.
3. Affinitás Kromatográfia:
az Affinitáskromatográfia molekuláris konformáción alapuló elválasztási technika, amely gyakran alkalmaz alkalmazásspecifikus gyantákat. Ezeknek a gyantáknak a felületéhez ligandumok kapcsolódnak, amelyek specifikusak az elválasztandó vegyületekre. Leggyakrabban ezek a ligandumok az antitest-antigén kölcsönhatásokhoz hasonló módon működnek. Ez a” lock and key ” illeszkedés a ligandum és a célvegyület között nagyon specifikussá teszi, gyakran egyetlen csúcsot generál, miközben a mintában minden más megmarad.
sok membránfehérje glikoprotein, és lektin affinitás kromatográfiával tisztítható. A detergensben oldódó fehérjék hagyhatók kötődni egy kromatográfiás gyantához, amelyet úgy módosítottak, hogy kovalensen csatolt lektin legyen.
hirdetések:
azokat a fehérjéket, amelyek nem kötődnek a lektinhez, lemossák, majd specifikusan kötött glikoproteinek eluálhatók nagy koncentrációjú cukor hozzáadásával, amely versenyez a kötött glikoproteinekkel a lektinkötési helyen. Egyes lektinek nagy affinitással kötődnek a glikoproteinek oligoszacharidjaihoz, amelyek nehezen versenyeznek a cukrokkal, és a kötött glikoproteineket a lektin denaturálásával kell felszabadítani.
4. Fémkötés:
egy általános technika magában foglalja a 6-8 hisztidinek a fehérje C-terminálisába. A polihisztidin erősen kötődik a kétértékű fémionokhoz, például a nikkelhez és a kobalthoz. A fehérje áthaladhat egy immobilizált nikkelionokat tartalmazó oszlopon, amely megköti a polihisztidin címkét. Minden címkézetlen fehérje áthalad az oszlopon.
a fehérje eluálható imidazollal, amely versenyez a polihisztidin címkével az oszlophoz való kötődésért, vagy a pH csökkenésével (jellemzően 4,5-re), ami csökkenti a címke affinitását a gyanta iránt. Míg ezt az eljárást általában rekombináns fehérjék tisztítására használják egy módosított affinitási címkével (például a 6xhis-tag vagy Clontech ‘ s HAT tag), természetes fehérjékhez is használható, amelyek inherens affinitással rendelkeznek tor kétértékű kationok.
5. Immunoaffinitás Kromatográfia:
az Immunoaffinitás kromatográfia egy antitest specifikus kötődését használja a célfehérjéhez a fehérje szelektív tisztítására. Az eljárás magában foglalja az antitest immobilizálását egy oszlop anyagához, amely ezután szelektíven megköti a fehérjét, miközben minden más átfolyik. A fehérje Ix eluálható a pH vagy a sótartalom megváltoztatásával. Mivel ez a módszer nem foglalja magában a címke tervezését, természetes forrásokból származó fehérjékhez használható.
6. HPLC:
a nagy teljesítményű folyadékkromatográfia vagy a nagynyomású folyadékkromatográfia a kromatográfia egyik formája, amely nagy nyomást alkalmaz az oldott anyagok gyorsabb áthaladására az oszlopon. Ez azt jelenti, hogy a diffúzió korlátozott, és a felbontás javul. A leggyakoribb forma a “fordított fázisú” HPLC, ahol az oszlop anyaga hidrofób.
a fehérjéket növekvő mennyiségű szerves oldószer, például acetonitril gradiensével eluáljuk. A fehérjék hidrofóbitásuk szerint eluálódnak. HPLC-vel történő tisztítás után a fehérje olyan oldatban van, amely csak illékony vegyületeket tartalmaz, és könnyen liofilizálható. A HPLC-tisztítás gyakran a tisztított fehérjék denaturálódását eredményezi, ezért nem alkalmazható olyan fehérjékre, amelyek nem spontán újrafoldódnak.
