a fluoreszcens festékekkel történő Többszínű festést aktívan használják a biológiai anyagok (például fehérjék, lipidek, nukleinsavak és ionok) eloszlásának megfigyelésére a szövet-és sejtkutatás területén. A fluoreszcencia-megfigyelés detektálási technológiája olyan szintre fejlődött, amelyen egyetlen fluoreszcens festékmolekula a legjobb körülmények között kimutatható. Ez a szakasz áttekinti a fluoreszcencia élettartamú képalkotó mikroszkópia (FLIM), egy új fluoreszcencia mikroszkópos technológia. A többszínű festés mellett a fluoreszcencia élettartamú képalkotás felhasználható azon tényezők megjelenítésére is, amelyek befolyásolják a festékmolekula fluoreszcencia élettartamának tulajdonságait, vagyis a molekula körüli környezet állapotát.
hullámhossz-spektroszkópia
a hagyományos fluoreszcens mikroszkópia a fluoreszcens festékek színtulajdonságait használja, vagyis az azonosítás a színezékek közötti fluoreszcens spektrális jellemzők különbségein alapul. Ezzel a technikával öt vagy hat színezék a hullámhossztartományban ultraibolya nak nek közeli infravörös mikroszkóp alatt egyszerre használható, a színek összetévesztése nélkül.
élettartam spektroszkópia
minden fluoreszcens festék saját élettartammal rendelkezik gerjesztett állapotban. Az élettartambeli különbségek kimutatásával meg lehet különböztetni az azonos fluoreszcens színű festékeket, valamint azonosítani lehet az autofluoreszcenciát. Ezenkívül nagy jel-zaj képeket lehet elérni egy nagyon hosszú élettartamú szonda használatával, összehasonlítva a szokásosan használt fluoreszcens festékekkel. Például a platina koproporfirin élettartama milliszekundumos, míg a közönséges fluoreszcens festékek élettartama nanoszekundumos. Az ilyen viszonylag hosszú élettartamú fluoreszcens festékeket hamarosan szondákként használják a chipek DNS-kimutatására.
a fluoreszcencia élettartamú képalkotás lehetővé teszi a molekulákra vonatkozó információk megszerzését egy élő sejt megfigyelése közben. A fluoreszcencia élettartamát befolyásoló tényezők közé tartozik az ionintenzitás, a hidrofób tulajdonságok, az oxigénkoncentráció, a molekuláris kötődés és a molekuláris kölcsönhatás energiaátadással, amikor két fehérje megközelíti egymást. Az élettartam azonban független a festékkoncentrációtól, a fényfehérítéstől, a fényszóródástól és a gerjesztő fény intenzitásától. Ezért a fluoreszcencia élettartamú képalkotás lehetővé teszi számunkra, hogy pontos ionkoncentráció-mérést és fluoreszcencia rezonancia energiaátviteli (FRET) elemzést végezzünk.
a fluoreszcencia élettartamú képalkotásnak két módszere van: az idő-tartomány módszer és a frekvencia-tartomány módszer.
- Időtartományú FLIM-impulzuslézerrel történő gerjesztés utáni késleltetés esetén a fluoreszcens kép a képerősítő kapu működésével érhető el. Az élettartamot nanoszekundumban mérik egy néhány száz pikoszekundumos impulzusú lézerrel és egy nanoszekundumos zárral, mivel a gerjesztési állapot élettartama általában 1-20 nanoszekundum. A nagy sebességű kapu képerősítő kereskedelmi forgalomban kapható Hamamatsu Photonics K. K. (Hamamatsu, Japán). Az egyes pixeleknél a fluoreszcencia élettartama méréssel is megszerezhető, miközben a késleltetési időt változtatjuk, amíg egy kapu kinyílik. A fluoreszcencia élettartamának képei pseudocolor-ban jelennek meg élettartamuk szerint.
- a frekvenciatartomány FLIM-fluoreszcencia élettartamát a fluoreszcencia fáziseltolódásának és amplitúdójának csökkenésének mérésével számítják ki egy erősítésmodulátorral ellátott detektor segítségével, amikor a gerjesztő fényforrásként használt lézert modulálják (1-200 megahertz). A mérés történhet lézerszkenneléssel (fotoszorzóval) vagy töltéscsatolt eszközzel (CCD).
Alkalmazások
a szondát körülvevő környezetet azon a tényen alapul, hogy a fluoreszcencia élettartama érzékeny a hidrogénion-koncentrációra (pH), az oxigénre és a kalciumion-koncentrációkra. A kötődés vagy a molekulák közötti kölcsönhatás FRETTEL kombinálva is mérhető.
kalciumion-koncentráció képalkotás
amikor a kalciumion fluoreszcens szondához, például Furához, Fluo-3-hoz vagy Kalciumzöld-hez kötődik, mind a fluoreszcencia élettartama, mind a fluoreszcencia intenzitása megváltozik. Az ionkoncentráció mérésének hagyományos eljárása az intenzitás változására összpontosít. A kalciumion-koncentráció változása szerint a színezékek aránya a kötött és a nem kötött kalciumion között változik, és ez később a mintában lévő mérési pont fluoreszcencia élettartamának megváltozásához vezet. A kalciumion-szonda mellett ez a technika pH és más ionok, például nátrium-ion és magnéziumion mérésére is alkalmazható.
fluoreszcencia rezonancia energiaátadás (FRET)
jelenleg a zöld fluoreszcens fehérje (GFP) variánsok (eltérő fluoreszcens színű GFP) által végzett kutatásokat végzik. A FRET lehetővé teszi a kölcsönhatások (asszociáció vagy disszociáció) mérését két fehérje között, amelyeket fluoreszcens festékpárral jelölnek. A donor fluoreszcens festék rövidebb gerjesztési / emissziós hullámhosszakkal rendelkezik, amelyek energiát szolgáltatnak egy akceptor fluoreszcens festékhez. A donorfesték gerjesztési állapotának élettartama változó attól függően, hogy létezik-e az akceptor (az energiát befogadó festék). Az élettartamon alapuló mérés jobb számszerűsítést tesz lehetővé, mivel a detektálás során nem szükséges figyelembe venni a fluoreszcencia átfedését.
klinikai képalkotás
mivel egyes szöveti és citodiagnosztikai minták erős autofluoreszcenciával rendelkeznek, megkíséreltek hosszú élettartamú (akár milliszekundumos) próbákat használni. A hosszú élettartamú próbák szintén hasznosak fluoreszcencia in situ hibridizáció (FISH), mert ezzel a technikával korlátozott az egyidejűleg használható Színek száma. A vér hidrogénion-koncentrációját, valamint az oxigén-és szén-dioxid-nyomást már megmérték a fluoreszcencia élettartama alapján, bár ilyen mérések mikroszkóppal még mindig nem lehetségesek.
internetes források
- fluoreszcencia spektroszkópiai Központ – Joseph R. Lakowicz a Marylandi Egyetemen, ez a weboldal kiváló információforrás a fluoreszcencia élettartamú képalkotásáról és a fluoreszcencia spektroszkópia és mikroszkópia egyéb aspektusairól.
- Kentech Instruments – a Kentech nagyfeszültségű szilárdtest impulzusgenerátorokat és optikai kapuzott képalkotó rendszereket gyárt fluoreszcens élettartamú képalkotáshoz.
- Hamamatsu Photonics – a kiváló digitális fényképezőgép-rendszerek mellett a Hamamatsu fotomultiplikátorokat, avalanche fotodiódákat és nagysebességű kapu képerősítőket is gyárt.
- PRS BioSciences – szakosodott biológiai fluoreszcens mikroszkópia, PRS BioSciences gyárt egy utángyártott idő-kapuzott rendszer, amely lehet igazítani számos kutatási mikroszkópok.
