ezt a bejegyzést Kurt Thorn, az UCSF Nikon képalkotó Központjának munkatársa készítette.
az élő sejtek képalkotási kísérleteinek általános követelménye az a képesség, hogy egyszerre több fluoreszcensen megjelölt fajt kövessenek. Ehhez fluoreszcens fehérje címkékkel több fluoreszcens proteinre van szükség, amelyek gerjesztési és emissziós spektruma eléggé különbözik ahhoz, hogy a mikroszkóp különböző fluoreszcens csatornáiban lehessen őket ábrázolni. A fluoreszcens fehérjék elterjedésével az elmúlt években számos fluoreszcens fehérje kombináció létezik, amelyek együtt ábrázolhatók, de ez azt is jelenti, hogy a fluoreszcens fehérjék megválasztása némi gondolkodást igényel.
az első lépés a fluoreszcens fehérjék kiválasztásában a többszínű képalkotó kísérlethez, hogy tisztában legyen azzal, hogy milyen fluoreszcens fehérjék állnak rendelkezésre. Mivel minden hónapban új fluoreszcens fehérjéket tesznek közzé, kihívást jelent az adott alkalmazáshoz a legjobb fehérje kiválasztása. Annak érdekében, hogy lépést tarthasson a legújabb fluoreszcens fehérjékkel, interaktív grafikont és táblázatot tartok fenn a jelenleg elérhető legjobb fluoreszcens fehérjékről.
kompatibilis fluoreszcens fehérjék kiválasztása
a fluoreszcens fehérjék együttes leképezéséhez ugyanazokat a tényezőket kell figyelembe venni, mint az egyes fluoreszcens fehérjék kiválasztásakor (fényerő, fotostabilitás stb.; Lásd az előző blogbejegyzést ezen tényezők további megvitatásához). Ezenkívül olyan fluoreszcens fehérjéket kell választania, amelyek megkülönböztethetők egymástól, és amelyek a használni kívánt mikroszkóp(ok) optikájával leképezhetők. Annak pontos meghatározásához, hogy két fluoreszcens fehérje elválasztható-e egymástól, ismerni kell gerjesztési és emissziós spektrumukat, de jó ökölszabály, hogy mind a gerjesztési csúcs hullámhosszát, mind a csúcs emissziós hullámhosszát 50-60 nm-rel kell elválasztani. Például a CFP (ex 430 nm / em 474 nm) és az YFP (ex 514 nm / em 527 nm) együtt leképezhető, de a CFP és a GFP (ex 488 nm / em 507 nm) némi áthallást mutat a két fluoreszcens fehérje között. Ha olyan fluoreszcens fehérjéket kell ábrázolnia, amelyek spektruma átfedi egymást, vannak olyan technikák, mint a spektrális keverés, amelyek felhasználhatók a fluoreszcens fehérjék elválasztására, de ezek túlmutatnak ezen a poszton.
a fluoreszcens fehérjék kompatibilisek a mikroszkóp optikájával?
annak megállapításához, hogy az Önt érdeklő fluoreszcens fehérjék kompatibilisek-e a mikroszkóp optikájával, érdemes összehasonlítani a fehérje gerjesztési és emissziós spektrumát a mikroszkóp szűrőkészleteivel vagy lézereivel. Ideális esetben azt szeretné, hogy jelentős átfedés legyen a gerjesztési és emissziós szűrők, valamint a fehérje gerjesztési és emissziós spektruma között, hogy a fehérjét jól gerjesztse a mikroszkóp, és a fehérje fluoreszcens emisszióját hatékonyan összegyűjtse a mikroszkóp. A fluoreszcens fehérje és a szűrőhalmaz közötti egyezés összehasonlításához számos szűrőhalmaz-gyártó biztosít eszközöket a fehérjék és színezékek fluoreszcens spektrumainak és szűrőinek ábrázolására(lásd Chroma, Semrock vagy Omega). Bár ezek nem tartalmazzák az összes általánosan használt fluoreszcens fehérjét (különösen nem a legutóbb közzétett fehérjéket), jó kiindulópont lehet. Sok esetben elegendő egy spektrumot használni egy szorosan rokon fehérjéhez, ha tudja, hogy az érdeklődő fehérje hasonló spektrummal rendelkezik. Például itt van egy képernyőkép a Chroma Spectra Viewer-ből, amely összehasonlít egy szabványos Cy3 vagy rodamin szűrőkészletet (Chroma #49004) mind az mCherry, mind a TagRFP spektrumával.
itt a TagRFP spektrum sötétebb színekkel, az mCherry spektrum pedig világosabb színekkel jelenik meg; a gerjesztési spektrumok kékek, az emissziós spektrumok pedig pirosak. Egyik sem felel meg tökéletesen a szűrőkészletnek, de a gerjesztő szűrő a TagRFP gerjesztés csúcsának nagyobb részét gerjeszti, az emissziós szűrő pedig a TagRFP emisszió nagyobb részét gyűjti össze, mint az mCherry emisszió. Ehhez a szűrőkészlethez azt várnánk, hogy a TagRFP fényesebb jelet adjon, mint az mCherry. Általában a rodamin / Cy3-ra tervezett szűrőkészletek jobban működnek rövidebb hullámhosszú vörös fluoreszcens fehérjékkel, mint a TagRFP vagy az mRuby2, mint a hosszabb hullámhosszú fehérjék, mint az mCherry. A fluoreszcencia és a szűrőkészletek hátterét lásd a bevezetés a fluoreszcencia mikroszkópos előadáshoz az iBiology-ban.
általánosan használt szűrő készletek & releváns fluoreszcens fehérjék
a többszínű képalkotáshoz általánosan használt szűrőkészletek közé tartoznak a CFP, YFP és RFP vagy a Sedat Quad szűrőkészlet, amelyet DAPI / fluoreszcein / Rhodamine / Cy5 (pl. Semrock) és a hasonló 4-lézer kombináció konfokális (pl. 405 / 488 / 561 / 640 nm). Kezünkben a legjobb fluoreszcens fehérjék a képalkotáshoz ezzel a készlettel az mTagBFP2, az EGFP vagy a továbbfejlesztett GFP változatok egyike, az mRuby2 vagy a TagRFP-T, valamint egy infravörös fluoreszcens fehérje, például az iFP1.4 vagy az iFP2.0. Vigyázzon, hogy ezek az infravörös fluoreszcens fehérjék kofaktorként biliverdint igényelnek, ezért a maximális fényerő érdekében szükség lehet sejtjeinek biliverdinnel történő kiegészítésére. Emlőssejtekben az EGFP egyik továbbfejlesztett hajtogatási változata, például a mEmerald vagy a lóhere, valószínűleg a legjobb; a mNeonGreen egy még újabb zöld fluoreszcens fehérje, amely állítólag rendkívül fényes. Az S. cerevisiae, számos zöld és piros fluoreszcens fehérjét teszteltünk ezzel a szűrőkészlettel, és beszámoltunk a fényerő méréséről. Itt az EGFP felülmúlja a továbbfejlesztett hajtogatási változatokat, feltehetően az alacsonyabb növekedési hőmérséklet miatt. Ez azonban azt is sugallja, hogy nincs egyetlen fluoreszcens fehérje, amely minden organizmus számára optimális lenne, és ha a legfényesebb jelet szeretné, előfordulhat, hogy több fehérjét kell kipróbálnia az érdeklődésre számot tartó rendszerben. Végül, ebben a fehérjekészletben általában a zöld és a vörös fehérjék a leginkább kimutathatók, ezért a legkevésbé bőséges fehérjék megjelölésére kell használni, a kék és az infravörös csatornákkal, amelyeket a bőségesebb fehérjék vagy a jelölő rekeszek használnak.
remélem, ez némi fényt derít a fluoreszcens fehérjékkel végzett Többszínű képalkotásra. A megfelelő mikroszkóppal és a fluoreszcens fehérjék megfelelő megválasztásával a négy szín egyidejű leképezése meglehetősen egyszerű.
Köszönjük vendég Bloggerünknek!
Kurt Thorn az UCSF docense, ahol a Nikon képalkotó központját irányítja. Biofizikai doktori fokozatát az UCSF-től szerezte Ronald Vale laboratóriumában, ezt követően a Harvard Egyetem Bauer genomikai Kutatóközpontjának munkatársa volt. Tudjon meg többet a labor weboldalán vagy a mikroszkópos blogján.
