10.4.2 trehalóz emlőssejtek krioprezervációjához
a Krioprezervációt általában a sejtek hosszabb ideig történő megőrzésére alkalmazzák rendkívül alacsony hőmérsékleten. A fagyasztás és felolvasztás során bekövetkező fizikai változások azonban károsak lehetnek a sejtek túlélésére és működésére. Ezért krioprotektánsokat kell hozzáadni a sejtekhez a krioprezerváció során. A trehalóz alkalmazása a sejtek krioprotektánsaként abból a felfogásból fakadt, hogy a sejtmembrán mindkét oldalán polihidroxi-vegyületekre van szükség ahhoz, hogy a sejteket hosszabb ideig megőrizzék . A trehalózt több csoport vizsgálta, mint a különböző emberi sejtek krioprezervációjának védőszerét.
Beattie et al. a trehalózt a DMSO-val együtt vezették be a hasnyálmirigy Langerhans sejtjeibe termotróp folyadékfázisú átmenet alkalmazásával . A trehalózzal történő krioprezerváció a felnőtt szigetek 92% – os gyógyulását eredményezte, szemben a DMSO-val történő csak 58% – os gyógyulással. Tizennégyszer több inzulint találtak a trehalózzal krioprezervált szigetek oltványaiban, mint a trehalóz nélkül. A trehalózzal tartósított emberi magzati szigetszerű sejtcsoportok (ICC-k) helyreállítása 94% volt, szemben a trehalóz nélküliek 42% – ával. Meztelen egerekbe történő átültetéskor a trehalózzal krioprezervált ICC-ből származó graftok inzulintartalmának 15-szeres növekedését figyelték meg. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a trehalóz hozzáadása krioprezervánsként az emberi hasnyálmirigy endokrin szövetének nagyon magas túlélési arányához vezet.
Toner és munkatársai alacsony koncentrációjú trehalózt vezettek be emlős sejtekbe a pórusképző fehérje alfa-hemolizin géntechnológiával módosított változatával, és megállapították, hogy az intracelluláris trehalóz nagymértékben javíthatja ezeknek a sejteknek a túlélését a krioprezerváció során . A krioprezervált egér fibroblasztok és humán keratinociták hosszú távú, olvadás utáni túlélési aránya 80%, illetve 70% volt, 0,2 m intracelluláris trehalóz-koncentráció mellett. Az intracelluláris trehalóznak kedvező hatása van a szárított emlőssejtek membránintegritására is: az intakt plazmamembrán több mint 90% – os visszanyerését figyelték meg szárításkor és a sejtek enyhe körülmények között néhány hétig történő tárolásakor .
a trehalóznak az emberi májsejtek krioprezervációjára gyakorolt hatását Katenz et al. . A 10% DMSO-t és 0,2 M trehalózt tartalmazó táptalajban fagyasztott májsejtek szignifikáns javulást mutattak az olvadás utáni sejtek életképességében és a bevonat hatékonyságában az önmagában alkalmazott DMSO-hoz képest. A krioprezerváció során a trehalóz jelenléte szintén megnövekedett teljes fehérjeszintet eredményezett a csatolt sejtekben, magasabb albuminszekréciós szinteket és alacsonyabb aszpartát-amino-transzferáz szinteket a felolvasztás után.
az őssejtek fontos eszközök a hematopoiesis vizsgálatához, új terápiás stratégiák kidolgozásához, valamint bizonyos betegségek modellrendszereinek kidolgozásához. A krioprezerváció fejleményei ellenére az olvadás utáni sejthalál továbbra is fontos kérdés. Martinetti et al. használt trehalóz krioprezerválni tiszta vérképző őssejteket és progenitor sejteket a perifériás vérből annak érdekében, hogy megakadályozzák a sejtek elvesztését, amely a normál krioprezerváció során következik be . A CD34 felszíni ősmarkerének expresszióját értékeltük, és 1 M trehalózról kiderült, hogy jobb krioprotekciót biztosít a CD34+ sejteknek, amelyek nagyobb sejtszámmal és sejt életképességgel rendelkeznek, összehasonlítva a DMSO-t alkalmazó standard fagyasztási módszerrel. Ezenkívül a trehalózzal rövidebb és hosszabb ideig tartó krioprezerváció megtartotta a CD34+ sejtek azon képességét, hogy felolvasztás után megakariopoetikus sejtekké differenciálódjanak. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a trehalóz képes megőrizni az őssejtek életképességét és funkcióit krioprotektánsként alkalmazva.
a vörösvértestek és a vérlemezkék hosszú távú tárolása a magas fokú életképesség fenntartása mellett fontos következményekkel jár a vérátömlesztésben és a klinikai orvoslásban. Satpathy et al. leírt egy módszert a vörösvértestek extracelluláris közegből származó trehalózzal való feltöltésére ozmotikus egyensúlyhiány és foszfolipid fázisátmenet alkalmazásával, amely 40 mM-es intracelluláris trehalóz-koncentrációt eredményezett . Megállapították, hogy a trehalóz hosszabb ideig ozmotikus védelmet nyújt a vörösvértesteknek. A trehalózzal töltött vörösvértestek fagyasztva szárítása, majd rehidratálás 55% – os túlélést eredményezett morfológiájuk megtartásával. A túlélő sejtek ATP-t és 2,3-difoszfoglicerátot (DPG) szintetizáltak, és alacsony volt a methemoglobinszintjük. A SOD és a kataláz aktivitása, valamint a hemoglobin másodlagos szerkezete a fagyasztva szárított vörösvértestekben nagyon hasonló volt a friss Vörösvértestekéhez. Ez a tanulmány kimutatta, hogy a hemoglobin stabilizálásához trehalóz terhelés szükséges, és fontos lépést jelentett a vörösvértestek krioprezervációja felé.
az emberi vérlemezkék normál tárolási ideje a vérbankokban 5 nap, amely után eldobják őket, ami a transzfúzióhoz szükséges vérlemezkék krónikus hiányát eredményezi. A vérlemezkék hosszabb ideig tartó krioprezervációja felé tett erőfeszítésként Wolkers et al. leírt egy módszert a trehalóz bejuttatására az emberi vérlemezkék citoplazmájába . Megállapították, hogy a trehalózt az emberi vérlemezkék könnyen felveszik 37 Kb, több mint 50% – os terhelési hatékonysággal. A trehalózzal töltött vérlemezkék fagyasztva szárítása és rehidratálása az intakt vérlemezkék kiváló helyreállítását eredményezte, 85% – os túlélési arány mellett. Ezek a vérlemezkék szinte azonos módon reagáltak a friss vérlemezkékre az agonisták, például a trombin, az ADP, a kollagén és a risztocetin felé. A trehalózzal töltött vérlemezkék membrán mikrodomainjei és fehérje komponensei a fagyasztva szárítás és rehidráció után sértetlenek maradtak.
a trehalóz védőhatását a szaruhártya hámsejtjeiben is kimutatták. A tenyésztett szaruhártya hámsejtjeinek trehalózzal történő előinkubálása, majd szárítása az elhalt sejtek százalékos arányának jelentős csökkenését eredményezte a kontroll közeghez képest . A védőhatást ex vivo is megerősítették enucleated sertésszemekben, ahol a trehalózzal inkubált Szövet láthatóan simább volt . Ezek az eredmények jelzik a trehalóz hasznosságát a szemészetben és potenciális alkalmazását szemcseppként száraz szem szindróma esetén.
a trehalóz alkalmazását organellák krioprezerválására Yamaguchi et al., aki a trehalózt krioprotektánsként használta a fagyasztott mitokondriumokhoz . A trehalóz jelenlétében fagyasztott mitokondriumok mitokondriális külső membrán (MOM) integritását és reakcióképességét mutatták a Bcl-2 család fehérjéihez hasonlóan, mint a friss mitokondriumok. Az ULTRASTRUKTÚRA, az ATP szintézis, a transzmembrán potenciál, a kalcium által kiváltott duzzanat, valamint a prekurzor fehérjék importja és feldolgozása szintén megmaradt trehalóz jelenlétében. Ez ellentétben áll a szokásos szacharóz-mannit pufferrel, amelyet gyakran szivárgó mitokondriumok fagyasztására használnak. Így a trehalóz képes volt megtartani a mitokondriumok biológiai jellemzőinek nagy részét, és a trehalóz-fagyasztott mitokondriumok felhasználhatók az apoptózis és más mitokondriális funkciók kutatására, amelyek az anya integritására támaszkodnak.
a trehalózt hosszabb ideig használták szervek megőrzésére. Egy “ET-Kiotói megoldást” dolgozott ki a WADA csoport a kutya tüdő >30 órán keresztül történő megőrzésére anélkül, hogy befolyásolná az endothel sejtek és az érrendszer teljesítményét . A vakcinák és antitestek tartós stabilizálását és megőrzését trehalóz alkalmazásával is sikerült elérni.
