rövid bevezetés: Blotting technikák
A Blottot a molekuláris biológiában használják fehérjék és nukleinsavak azonosítására, és széles körben használják diagnosztikai célokra. Ez a technika immobilizálja a kérdéses molekulát egy hordozón, amely nitrocellulóz membrán vagy nejlon. Hibridizációs technikákat alkalmaz a specifikus nukleinsavak és gének azonosítására.
a blot technika olyan eszköz, amelyet biomolekulák, például ad DNS, mRNS és fehérje azonosítására használnak a génexpresszió különböző szakaszaiban. A fehérjeszintézis magában foglalja egy DNS-szegmens expresszióját, amely mRNS-vé alakul át a megfelelő fehérje előállításához.
A blotolás altípusai, mint például az északi, nyugati & déli, a keresett célmolekulától függenek. Ha egy DNS-szekvencia az alapja vagy kódja egy fehérjemolekulának, akkor az adott érdekes DNS-molekula déli Blotolási technikával blotolható. A génexpresszió során, amikor a DNS-t mRNS-ként expresszálják egy fehérjetermeléshez, ezt a folyamatot Északi blottolással lehet azonosítani. Végül a kódolt mRNS termeli az érintett fehérjét, ezt a fehérje-azonosítást Western Blottolással lehet elvégezni.
általános eljárás blot
- homogenizálja a mintát.
- a kérdéses molekula elválasztása elektroforézis membránnal.
- a molekulák átvitele nitrocellulóz membránra/ nejlon membránra.
- hibridizáció vagy a molekula azonosítása
Northern blot
Northern blot a génexpresszió vizsgálatára használt technika. Ez bizonyos RNS (vagy izolált mRNS) kimutatásával történik. az mRNS általában a teljes RNS-szekvencia 5% – ában jelenik meg. Ez a módszer feltárja az adott gén azonosságát, számát, aktivitását és méretét. Ez a blottolási technika szövet vagy szervezet növekedésére is használható. A differenciálódás és a morfogenezis különböző szakaszaiban az RNS bősége megváltozik, és ez a technika segítségével azonosítható. Segíti a kóros, beteg vagy fertőzött állapot molekuláris szintű azonosítását is. A northern blot technikát 1977-ben fejlesztette ki James Alwine, David Kemp és George Stank a Stanford Egyetemen. A technika a déli blotting folyamat hasonlósága miatt kapta a nevét. Az elsődleges különbség e két technika között az, hogy az északi blot csak az RNS-re vonatkozik.
elv
mint minden normál blotolási technika, az északi blot az elektroforézissel kezdődik az RNS-minták méret szerinti elválasztására. Az elektroforézis elválasztja az RNS-molekulákat a nukleinsavak töltése alapján. A nukleinsavak töltése arányos a nukleinsavszekvencia méretével. Így az elektroforézis membrán elválasztja a nukleinsav-szekvenciát az RNS-szekvencia méretének megfelelően. Azokban az esetekben, amikor célszekvenciánk mRNS, a mintát oligo-cellulóz-kromatográfiás technikákkal izolálhatjuk, mivel az mRNS-t a poli(A) – farok jellemzi. Mivel a gélmolekulák törékeny természetűek, az elválasztott szekvenciák átkerülnek a nejlonmembránokba. A nylon membrán kiválasztása hozzájárul ahhoz a tényezőhöz, hogy a nukleinsavak negatív töltésűek a természetben. Miután az RNS-molekulákat átvitték, kovalens kötéssel immobilizálják. Ezután hozzáadjuk a szondát, a szonda kiegészítheti az ss DNS-szekvenciát. A formamidot általában blotpufferként használják, mivel csökkenti az izzítási hőmérsékletet.
eljárás
- az összegyűjtött szövet-vagy tenyészmintát először homogenizálják. A minták összehasonlításra reprezentatívak lehetnek a tenyészet különböző típusaira, vagy a tenyészeten belüli növekedés különböző szakaszainak tanulmányozására.
- az RNS-szekvenciát elválasztjuk az elektroforézis egységben a nukleinsav-elválasztás céljára agarózgélt használunk.
- most az elválasztott RNS-szekvencia átkerül a nejlon membránra. Ez úgy történik, két mechanizmus kapilláris hatás és az ionos kölcsönhatás.
- az átviteli műveletet úgy végezzük, hogy a gélt a következő sorrendben tartjuk. Először az agaróz gélt helyezzük a köteg aljára, majd a blotting membránt. Ezen papírtörölközők tetejére enyhe súlyt (üveglapot) helyeznek. A teljes beállítást egy főzőpohárban tartják, amely átviteli puffert tartalmaz.
- a nejlonmembránra átvitt RNS-t ezután UV-sugárzással rögzítjük.
- a rögzített nejlon membránt ezután szondákkal keverjük össze. A szondákat kifejezetten az érdekes génhez tervezték, így hibridizálódnak az RNS-szekvenciákkal a bloton, amely megfelel az érdekes szekvenciának.
- a blot membránt mossuk, hogy eltávolítsuk a nem kívánt szondát
- a jelölt szondát kemilumineszcenciával vagy autoradiográfiával detektáljuk. Az eredmény sötét sávok lesznek a röntgenfilmben.
gél és szondák
az RNS-mintákat formaldehidet denaturáló szerként használó agarózgélek alkalmazásával választjuk el, de kis RNS-vagy mikro-RNS-szekvenciákban poliakrilamid-szekvenciák is alkalmazhatók denaturáló szerként karbamiddal. Az etidium-bromid festőanyagként használható. Kétféle jelölő van a méret jelölésére. Az RNS-szekvenciák méretének meghatározására RNS-létrát és riboszomális alegységet használnak.
a próbák kiegészíthetik a kérdéses RNS egészét vagy egy részét. Ezek lehetnek 25 komplementer bázispár RNS, DNS vagy oligonukleotidjai a cél RNS-hez. RNS-szondák esetén az invitro által előállított szondákat használják, mivel az invivo szondák denaturálódhatnak a szigorú mosás miatt. CDNS esetén a szondákat kemilumineszcencia esetén radioaktív izotópokkal, alkalikus foszfatázzal vagy torma-peroxidázzal jelöljük.
