onkológiai jelentések

Bevezetés

bár a közelmúltban új terápiákat vezettek be a klinikai gyakorlatba az előrehaladott prosztatarák kezelésére, a prosztatarák 2014-ben továbbra is a férfiak második halálosabb rákja az Egyesült Államokban (1). Új terápiás célokra és stratégiákra sürgősen szükség van a prosztatarákos betegek klinikai kimenetelének további javítása érdekében.

egy ígéretes potenciális terápiás célciklinfüggő kináz 5 (CDK5). A CDK5 egy szerin / treonin kinaszestrukturálisan hasonló a többi CDK-hez (2). Úgy tűnik, hogy a CDK5-nek nincs jelentős szerepe a sejtciklus szabályozásában (3,4). Jól jellemezték a központi idegrendszer fejlődésében betöltött domináns szerepe miatt, beleértve a neuronális migrációban, differenciálódásban és adhézióban játszott szerepeket (5,6). Weand mások ezt követően kimutatták, hogy a CDK5 fontos szerepet játszik a rák fejlődésében és a metasztázisban (7-12). Inprosztata rákos sejtekben kimutattuk, hogy a CDK5 kritikus forcitoskeletalis integritás, sejtvándorlás és invázió, valamint invivo volt a metasztázis szempontjából (7). A hasnyálmirigyrákban a CDK5 a KRAS-jelátvitel szerves része a központi jelentőségű RAL jelátviteli útvonalon keresztül, ezáltal potenciális ‘gyógyszerezhető’ célpontot biztosítva a mutáns KRAS daganatok számára (8). Ezek a vizsgálatok együttesen azt mutatják, hogy a CDK5 gátlása önmagában vagy más szerekkel kombinálva hatékony terápiás stratégiát biztosíthat ezekre és más ráktípusokra.

a jelen tanulmányban meghatároztuk azokat az ágenseket, amelyek különösen hatékonyak lennének a prosztatarák sejtjeiben a Cdk5 gátlásával kombinálva. Ezért elvégeztük a Johns Hopkins kábítószer-könyvtár (JHDL) képernyőjét. A JHDL 3360 gyógyszerészeti vegyület összegyűjtése, amelyek sikeresen befejezték az emberek biztonsági tesztelését különféle alkalmazásokhoz (13,14). Ezt a könyvtárat sikeresen alkalmazták rákterápiás vegyületek újrafelhasználására, beleértve a digoxin HIF1a inhibitorként (15), az itrakonazol pedig angiogén-gátló anyagként (16) történő azonosítását. Korábban a jhdl-t alkalmaztuk a cetrimonium-bromid és az irinotekán ascompounds azonosítására, amelyek fokozott daganatellenes aktivitással rendelkeznek a prosztatarákkal szemben, a metasztázis szuppresszor gén alacsony szintjét expresszáló sejtek N-mycdownregulated gén 1 (NDRG1) (17).Itt hasonló JHDL szűrést végeztünk prosztataráksejtekkel, amelyek különböznek a CDK5 aktivitásban. A tiloront in vitro szintetikus letalitással rendelkező vegyületként azonosították, inCDK5-hiányos prosztatarákos sejtekben.

anyagok és módszerek

sejttenyészet

PC3 prosztatarák sejtvonalakat nyertekatcc. Ezek a sejtek egy 62 éves prosztatarákos beteg csontmetasztázisából származnak. Emberi prosztata fibroblasztok, kindlyprovided Dr. J. Isaacs, nyertünk egy prosztata biopszia a62 éves prosztatarákos beteg egy Gleason pontszám 4. Mindkét sejtvonalat rpmi-1640 (Invitrogen)táptalajban termesztették és tartották fenn, kiegészítve 10% magzati szarvasmarha szérummal. A sejteket nedvesített inkubátorban tenyésztettük 37cc hőmérsékleten 5% CO2 atmoszférában.

a PC3 CDK5dn sejtvonal létrehozása

a CDK5 funkció elvesztése PC3 sejtekben történtd144nmutációt tartalmazó domináns negatív konstrukció transzfekciójával, amelyet dr. L. H. Tsai (Harvard Medical School)(18). Az alkalmazott protokollt korábban leírtuk (7). Röviden, a konstrukciót egy kétirányú Tet vektorba, a pBI-EGFP-be(BD Biosciences) szubklónoztuk, amelyhez zeocin rezisztencia gént adtak hozzá a kiválasztáshoz (Dr. K. Schuebel, Johns HopkinsUniversity School of Medicine). PBI-EGFP üres vektort vagy pBI-EGFPCDK5dn vektort transzfektáltunk PC3 sejtekbe, amelyek aTet-Off promoter konstrukciót, pTTa-t (BD Biosciences) tartalmaztak.

Western blot

Western blot a korábban leírtak szerint történt (19). Tíz mikrogramm fehérje került a gélre. Az elsődleges antitesteket feloldottukblokkoló puffer . 1:1000 hígítást alkalmaztak anti – CDK5-re (Sigma-Aldrich); az anti-vinculint (Millipore,Upstate) 1: 4000 arányban hígítottuk. A másodlagos antitesteket ATA 1:4000 hígítással hígítottuk. A sáv intenzitásának normalizálását végeztükki a házvezetőnő fehérje vinculin. A kifejlesztett blotok voltakkonzervált egy Microtek szkennerrel.

sebgyógyulási vizsgálat

a sebgyógyulási vizsgálatokat confluentPC3 kontroll (az üres pBI-EGFP vektort tartalmazó) vagy PC3 Cdk5dnsejtekkel végeztük. Egy gumihegyű kaparót használtak, hogy lekaparják a sejtek egy részét. Fény mikroszkopikus képeket rögzítettünk azonnal 24 hafter kaparás.

kis molekulájú könyvtári szűrés

a JHDL könyvtárat korábban leírták(13,14,17).A JHDL-vegyületek tárolását és szűrését a korábban leírtak szerint végeztük (17).Röviden, a PC3 kontroll és a CDK5dn sejteket 96 lyukú lemezekbe(1 603 sejt/kút) vetettük be, és egy éjszakán át hagytuk tapadni. Ezután 5 db, 200 mm indmso/H2O törzsoldatként tárolt gyógyszert adtunk a teljes rpmi közeghez, így a sejteket 10 km végső koncentrációban kezeltük. Után 48 h oftreatment, 20 a Celltiterből származó MTS reagens 66 a nem radioaktív Sejtproliferációs vizsgálatot mindegyikhez hozzáadtuk 2-4 órán át 37 C. A lemezeket asoftmax Pro lemezolvasó (molekuláris eszközök) segítségével elemeztük. A kezelt sejtek proliferációját összehasonlítottuk a DMSO-val kezelt PC3control vagy CDK5dn sejtek proliferációjával (proliferációs index). A PC3 CDK5dn sejtek proliferációs indexeit összehasonlítottuk a PC3 kontroll sejtek proliferációs indexeivel. PubMed vizsgálatot végeztünka potenciális találatok klinikai felhasználásának értékelése.

MTS vizsgálatok

MTS vizsgálatokat végeztünk a tiloron kezelés antiproliferatív hatásának mérésére. A tiloronedihidrokloridot (Sigma-Aldrich) 10 mM-es készletoldatként tároltuk DMSO-ban -20 kb. Ezer PC3 cellát vontunk be96-kútlemezek, amelyek 100-at tartalmaztak6l teljes RPMI média. Körülbelül 50% – os összefolyásnál tiloron-dihidrokloridot adtak be. Forexperiments a vegyületet teljes rpmi közegben hígítottuk, hogy megkapjuk a kívánt végső koncentrációt. 72 órás kezelés után(tiloron monoterápia) MTS reagenst adtunk hozzá, és a 490 nm-es abszorpciót SoftMax Pro lemezolvasóval határoztuk meg.A proliferációs indexeket kiszámítottuk; kezeletlen PC3 kontroll orCDK5dn sejteket (103 dB teljes rpmi közegben) használtunk kontrollként. A hallgató t-tesztjeit a p-értékek értékelésére végeztük.

Klonogén vizsgálatok

Klonogén vizsgálatokat végeztünk a hosszú távú értékelésheztúléléstiloron kezelés után. A prosztatarák sejtjeit 60 mm-es edényekben helyezték el, és megengedték, hogy tapadjanak. 50-60% – os összefolyásnál a sejteket 72 órán át tiloronnal kezeltük. ezt követően minden edényből 1 DB 103 sejtet vontunk be három példányban 60 mm-es edényekbe, és teljes rpmi táptalajban inkubáltuk 12 napig.A telepeket 90% metanolt és 10% kristály ibolya oldatot (2,3% kristály ibolya, 0,1% ammónium-oxalát és 20% etil-alkohol; Sigma) tartalmazó oldattal rögzítettük és festettük. A telepeket számítógépes szkennerrel (Microtek) ellenőrizték és manuálisan megszámolták.A hallgató t-tesztjeit annak értékelésére végeztük, hogy a sejtvonalak közötti különbségek statisztikailag szignifikánsak voltak-e.

3D növekedési vizsgálat

3D növekedési vizsgálatokat végeztünk a korábban leírt azonos protokoll felhasználásával (17). Röviden, a szferoidokat a PC3 sejtek 16 órán át történő tenyésztésével állítottuk elő függő cseppként egy párásított lemez felett egy CO2 inkubátorban, teljes RPMI közegben, amely 0,5% metilcellulózt tartalmaz. A szferoidokat beágyazták a kollagén mátrixba (BD Biosciences), tiloronnal kezelték, és Nikon Eclipse Ti mikroszkóppal (Nikon) ábrázolták a kezelés napján és hat nappal a kezelés megkezdése után. A Spheroid és a teljes (spheroidplus hajtások) területeket ImageJ-vel mértük. A hajtásnövekedést úgy számítottuk ki, hogy a gömböt/teljes területet a 6.napon elosztottuk a gömböt/teljes területet a 0. napon minden egyes gömb esetében. Minden egyes sejtvonalra és időpontra négy szferoid hajtásnövekedése volt átlagban. A statisztikai elemzéseket Student ‘ st-tesztek segítségével végeztük.

eredmények

a CDK5 aktivitás elnyomása

PC3 prosztatarákos sejteket választottak a JHDLcompound képernyőre erősen áttétes potenciáljuk és androgén függetlenségük miatt, ezáltal agresszív metasztatikuskasztrát-rezisztens prosztatarák. A CDK5 aktivitást gátolta egy domináns-negatív mutáció (CDK5144N) transzverziója és szelekciója. Ezeknek a PC3 CDK5dn sejteknek magasabb volt a totalCDK5 fehérjeszintje a PC3 kontroll sejtekhez képest (PC3 sejtek üres vektorral transzfektálva) (ábra. 1A). Az aound healing assay (8) megerősítette, hogy a CDK5 funkcionálisan inaktív ezekben a sejtekben; a PC3control sejtekkel ellentétben a PC3 CDK5dn sejtek nem voltak képesek behatolni a lekapart felületbe (ábra.1B).

Library screen for compounds targetingPC3 cells based on CDK5 activity

nagy áteresztőképességű szűrővizsgálatot végeztünk a PC3 sejteket CDK5 aktivitás alapján megcélzó vegyületek kiválasztására. A PC3control és a CDK5dn sejteket a jhdl összes vegyületével kezeltük 10 MHz-en 48 órán át. A szelektíven megcélzott találatok azonosításapc3 sejtek CDK5 expresszió alapján kiválasztottuk az összes vegyületetamely a proliferációs index aránya (CDK5dn / kontroll) 0,5 alatt vagy 1,5 felett volt (ábra. 2A).Ezenkívül a hits-nek legalább 10% – kal meg kellett gátolnia a PC3 sejtek sejtproliferációját, mivel kifejezetten azok a vegyületek érdekeltek, amelyek gátolják a sejtnövekedést (vízszintes és függőleges vonal a grafikonon). Kiválasztottunk minden olyan vegyületet is, amely gátolta a sejtproliferációt az inPC3 sejtekben 70% – kal (a grafikon bal alsó sarkában), mivel érdekeltek voltunk a potenciális rendkívül hatékony daganatellenes szerek azonosításában. Összesen 41 találatot választottak ki további értékelésre.

egy másodlagos szűrővizsgálatot végeztünk, amelyben az elsődleges szűrővizsgálat selectedhit-jeit 10 MHz-en 48 órán át a PC3control és CDK5dn cellákhoz adtuk három példányban, hogy kiszűrjük a hamis pozitív eredményeket (ábra. 2B). A határértékek valamivel kevésbé szigorúak voltak, mint az elsődleges képernyőn; a vegyületeket akkor tekintették találatnak, amikor a proliferációs indexek aránya(CDK5dn/kontroll) 0,7 alatt vagy 1,4 felett volt. Ez három olyan vegyület azonosítását eredményezte, amelyek szelektíven célozzákcdk5-expresszáló PC3 sejtek: rutilantin, etakridin-laktát éscetalkónium-klorid (ábra. 2C).Ezeket a vegyületeket nem használták daganatellenes szerekként, és intravénás daganatellenes szerekként való potenciális klinikai alkalmazásuk korlátozottnak tűnik (20-23). Egy másik vegyület, a tiloron analogR9536-DA, rendkívül hatékonyan gátolta mindkét izogén PC3 sejtvonalat (>70% gátlás), de valamivel hatékonyabban gátolta a PC3CDK5dn sejtek proliferációját (Arány CDK5dn/kontroll:0,687). A tiloron és analógjai antivirális aktivitással rendelkeznek, legalább részben interferon-induktorokként hatnak (24-26), és preklinikai és klinikai szempontból tumorellenes hatásúnak is bizonyultak (27,28).

a tiloron szelektíven célozza meg a PC3 sejteket alacsony CDK5 aktivitással

frissen oldotttiloron-dihidrokloriddal folytattuk kísérleteinket. 72 óra tiloron kezelés után atkülönböző koncentrációkban az IC50 – et PC3 CDK5dn sejtekben 8-12, MTS vizsgálatokban PC3 kontroll sejtekben pedig 15 MHz-en állapították meg (ábra. 3A). 8 mm-nél a proliferációs aktivitás 24% – kal, illetve 47% – kal csökkent a PC3 kontrollsejtekben és a Cdk5dnsejtekben (p=0,001). A tiloron toxicitásának értékelésérenormál prosztata sejtek, MTS vizsgálatokat végeztünk tiloronetreatment humán prosztata fibroblasztok (ábra. 3B). Ezeknek a sejteknek az érzékenysége a totiloron hasonló volt a PC3 kontroll sejtekéhez.

a tiloron gátló hatását a PC3 sejtekben tovább értékelték klonogén vizsgálatok elvégzésével (ábra. 3C). A PC3 CDK5dn sejtek is jelentősen érzékenyebbek voltak, mint a PC3 kontroll sejtek a tiloronra ebben a vizsgálatban. A 10 MHz-es tiloronnal végzett kezelés 40% – os klonogén túlélést eredményezett a PC3 CDK5dn sejtekben és 72% – ot a PC3 kontroll sejtekben(p=0,002).

szferoid növekedési vizsgálatot végeztünk a 3dtumor növekedésének és a PC3 sejtek inváziójának értékelésére tiloron kezelés után(ábra. 4). Mind a PC3 control, mind a PC3CDK5dn sejtek hasonló mértékben növekedtek a szferoid méretében hat nap alatt. Azonban a teljes méret (a szferoidok mérete plusz hajtások) nagyobb mértékben növekedett a PC3 kontrollsejtekben, megerősítve, hogy a kezeletlen PC3 CDK5dn sejtek csökkent invazív potenciállal rendelkeztek, mint a PC3 kontroll sejtekhez képest. Amikor a tiloront 5 MHz-en adták be, a PC3 kontroll szferoidok növekedési és invazív mintázata hasonló volt, mint a kezeletlen PC3 kontroll sejteké (p=0,59) (ábra. 4B, bal grafikon). Azonban, amikor a pentiloront ugyanolyan koncentrációban adták a PC3 Cdk5dnsejteknek, mind a szferoid méret, mind a teljes méret jelentős csökkenését figyelték meg (p<0,01), ami arra utal, hogy a tiloron sikeresen gátolja a szferoid növekedést és a PC3 CDK5dn sejtek invázióját, amikor 5 km-en adják be (ábra. 4B, jobb grafikon). 10 mm-nél mindkét izogén sejtvonal csökkentinvazív potenciál.

Vita

a jhdl-t, a jól jellemzett gyógyszerkészítményekből álló könyvtárat a kábítószer-célú vizsgálatok megkönnyítésére fejlesztették ki (29). A könyvtárban található vegyületek kiterjedt in vivo toxicitása és farmakokinetikai profilja lehetővé teszi e vegyületek gyors későbbi fejlődését. A jhdl számos vegyületét a rák és más terápiás alkalmazások klinikai vizsgálataihoz fejlesztették ki (13,14,16,17,30–32).

jelen tanulmányban a jhdl-t szűrtük olyan vegyületek, amelyek differenciálisan gátolják a rákos sejtek növekedését a CDK5 gátlás jelenléte; a tiloront és a tiloron analógot olyan szerekként azonosították, amelyek szelektíven célozzák meg a CDK5-hiányos Pc3prosztata rákos sejteket. A tiloront (Amixin IC) klinikainéhány országban orálisan aktív vírusellenes szerként alkalmazzák (25). A tiloront embereken tesztelték agyi gliómák, gégepillomatosis ésmellrák kezelésére (28,33,34).Bár daganatellenes hatékonyságról számoltak be, a tiloron iránti érdeklődés aa rákterápia alábbhagyott. A közelmúltban Zhou et al jelentett beúj tiloron analógok javított rákellenes aktivitással (35). Ezek az analógok ígéretesek lehetnekvizsgálatot, különösen CDK5 gátlással kombinálva.

azon lehetőség mellett, hogy a tiloron CDK5 gátlással kombinálva ígéretes lehet, a tiloron mint olyan szer azonosítása, amely szelektíven célozza meg a sejteket inaktív CDK5-vel, potenciális gyógyszercsoportokra utal a CDK5 gátlás hatékonyságának fokozására. A tiloront aninterferon induktorként jellemezték (24). Ez azt sugallja, hogy maga az interferon vagy egy alternatív interferoninduktor, például egy TLR agonista hasznos lehet aCDK5 inhibitorral kombinálva. Ennek ellenére más mechanizmusok is bevonhatók. Például a tiloron egy DNS-interkaláló szer is (24), és elképzelhető, hogy modulálhatja a kromatin szerkezetét és a génexpressziót. A tiloron egyéb funkciói, beleértve a jelátviteli útvonalat és a transzkripciós faktorinterakciókat (36,37), szintén részt vehetnek. További vizsgálatokra van szükség annak a pontos hatásmechanizmusnak a feltárásához, amellyel a tiloron szelektíven célozza meg a CDK5-negatív prosztataráksejteket.

Köszönetnyilvánítás

a szerzők szeretnék megköszönni professzorok P. J. Van Diestand E. Van der Wall támogatásukért és vitájukért és Professzoraikért.A. Carducci és J. T. Isaacs a laboratóriumok ellátásáértanyagokat. Ezt a tanulmányt a légiutas-kísérő Orvosi Kutatóintézet támogatta, NCI R01 CA085567, R01 CA134767, dod grantW81XWH-06-1-0139 és NCI sport grant P50 CA58236. Dr. Saal van Zwanenbergstichting és HuygensScholarship Program támogatásával.