PMC

1 a GST génfúziós fehérje expressziós rendszer minden aspektusára vonatkozó részletes protokollok és hibaelhárítási tippek a GE Healthcare kézikönyvében találhatók: GST Génfúziós rendszer, Termékszám: 18-1157-58, valamint a rekombináns fehérje kézikönyv, Termékszám: 18-1142-75. A kézikönyvek nyomtatott formában megvásárolhatók, vagy PDF formátumban elérhetők a GE Healthcare weboldalán.

2a vektor klónozásához és fenntartásához JM105 vagy hasonló törzs használata ajánlott. A BL21 és származékai, vagy egy másik proteázhiányos törzs ajánlott a maximális fehérje expresszióhoz. A citoplazmatikus proteáz géntermékekben, például lon, ompT, degP vagy htpR hiányos törzsek minimalizálhatják a túlexpresszált fehérje gazdaszervezet általi proteolitikus lebomlásának hatásait. Ne használjon olyan E. coli törzset, amely a rec1A allélt hordozza a pGEX plazmidok szaporítására, mivel a plazmid DNS delécióiról vagy átrendeződéséről számoltak be.

3glutation-Szefaróz 4B ömlesztett közeget használnak ebben a tisztítási protokollban. Ez a kromatográfiás közeg ideális a szűrési körülményekhez, és lehetővé teszi a könnyű méretezést. A tisztítások könnyen elvégezhetők gravitációs áramlással vagy alacsony nyomású kromatográfiás rendszerrel, vagy felhasználhatók centrifugáláson alapuló szakaszos tisztításokban. A GSTrap FF affinitási oszlopok 1 ml – es vagy 5 ml-es előrecsomagolt oszlopok, amelyek szintén rendelkezésre állnak, és sorba kapcsolhatók a méretezés érdekében. Ezek az oszlopok folyadékkromatográfiás rendszerrel, szivattyúval vagy fecskendővel használhatók. Ezen formátumok mellett a glutation-Szefaróz spin oszlopokban és 96 lyukú lemezformátumokban is elérhető a GST fúziós fehérje expressziójának és tisztítási körülményeinek gyors szűrésére.

a 4DFP rendkívül veszélyes neurotoxin. Kövesse a gyártó által megadott óvintézkedéseket, és a tiszta reagenst csak vegyszeres páraelszívóban kezelje.

5a proteázgátlók hozzáadása a lízis pufferhez segít megelőzni a célfehérje proteolitikus lebomlását az extrakció során. A lízis pufferhez hozzáadott proteázgátlók pontos koktélját azonban a célfehérje jellemzőihez kell igazítani. Szükség szerint redukálószereket, például 2-ME, DTT vagy TCEP 1-10 mM koncentrációban kell hozzáadni a pufferhez. Nemionos mosószer, például 1% Triton X-100 hozzáadása is hozzáadható a pufferhez az extrakció elősegítése érdekében.

6követés egy szűrési protokoll a fúziós fehérje expressziós szintjének ellenőrzésére Mini-tenyészetekben. A fehérje szintjének növekedése a várható molekulatömeg mellett egy SDS-PAGE gélen az iptg-vel történő indukció után jól jelzi a sikeres fehérje expressziót. Az indukció után a várt molekulatömegű kiemelkedő sávnak (a célfehérje molekulatömege + ~ 26 KDa a GST-rész esetében) láthatónak kell lennie. Ha gyanítható, hogy a fehérje alacsony szinten expresszálódik, a helyes expresszió ellenőrzése elvégezhető Western blot alkalmazásával, a célfehérjére vagy a GST-re specifikus antitesttel. Ha a mintákat nem azonnal elemzik az SDS-PAGE segítségével, hosszabb távú tárolás céljából egy éjszakán át tárolhatók 4CC-n vagy -20ccc-n.

1. több izolált telepet külön 50 ml-es centrifugacsőbe kell beoltani, amely 10 ml fontot tartalmaz, 100 Ft/ml ampicillinnel kiegészítve. Növekszik egy éjszakán át kultúra 37 Kb rázással.

2. másnap reggel adjunk hozzá 0,5 ml éjszakai tenyésztést 4,5 ml LB-hez, 100 KB/ml ampicillinnel. Növekszik 1 h 37 C.

3. távolítson el 1 ml nem indukált mintát. Centrifugáljuk és távolítsuk el a felülúszót. Fagyassza le vagy tárolja jégen, amíg készen áll az SDS-oldal futtatására.

4. adjunk hozzá IPTG-t 1 mM-es végső koncentrációhoz, majd további 2-3 órán át növekedjünk.

5. távolítson el 1 ml indukált mintát. Centrifugáljuk és távolítsuk el a felülúszót. Fagyassza le vagy tárolja jégen, amíg készen áll az SDS-oldal futtatására.

6. Reszuszpendáljuk a sejt pellet 200 6L SDS-oldal minta puffer; hő 3-5 perc 90 C.

7. elemezze 5-10 6L segítségével SDS-oldal, majd Coomassie kék festés (vagy 1-2 ml Western blot).

7. a mini-tenyészetekben termesztett minták egy adott fúziós fehérje oldhatóságának értékelésére is felhasználhatók (lásd a 6.megjegyzést a mini-tenyészet expressziós protokolljához). Az indukciós periódus végén a sejteket centrifugálással szüreteljük. Reszuszpendáljuk a pelletet 200 MHz-es hideg PBS – ben. Lyse a sejteket ultrahangos kezeléssel; tartsa a mintát jégen. Mentse el a lizátum egy kis alikvotját az SDS-PAGE általi elemzéshez. Centrifugáljuk a lizált mintát 15 percig. Távolítsa el a felülúszót egy külön csőbe. Reszuszpendáljuk a pelletet 200 6L PBS – ben. Elemezze a nyers lizátum egy részét, a felülúszót, és az újraszuszpendált pelletet SDS-oldal vagy Western blot segítségével. Ha a mintát mind a lizátumban, mind a felülúszó frakcióban megfigyeljük, a minta megfelelően oldódik. Ha a minta elsősorban a lizátumban és a reszuszpendált pelletben van jelen, akkor a minta nagy valószínűséggel elzáródásos testekben található. Azokban az esetekben, amikor a fehérje inklúziós testekben helyezkedik el, vizsgálja meg a különböző expressziós feltételeket, hogy az expresszió oldható formába kerüljön (lásd a 8.megjegyzést).

8 ha a fúziós fehérje elsősorban inklúziós testekben expresszálódik (pl. > 80% oldhatatlan), különböző stratégiák alkalmazhatók az oldhatóság javítására. Gyakran előfordul, hogy az indukció alacsonyabb hőmérsékleten (15-25 kb C) hatékonyan elmozdítja az expressziót az inklúziós testekről az oldható frakcióra. Az alacsonyabb hőmérsékleten indukált sejtek lassabban növekednek, és éjszakai indukciós periódusokat igényelnek. Egyes esetekben szükség lehet alternatív gazdatörzsek alkalmazására vagy a plazmidszerkezet módosítására. Ha a fúziós fehérje elsősorban az inklúziós testekben marad, még az oldható fehérje megszerzésének kísérlete után is, érdemes lehet növelni az e termelését. coli és tisztítsa meg elegendő fehérjét a rendelkezésre álló kis mennyiségű oldható fehérjéből. Bizonyos esetekben más fúziós fehérje címkéket kell feltárni.

9 Az alacsony fehérje expressziós szint a ritka kodonhasználat eredménye lehet. Ebben az esetben az E. coli egy másik törzsére való áttérés, amely extra transzkriptumokat tartalmaz a ritka kodon tRNS számára, jelentősen javíthatja a fehérjetermelést. Különböző média készítmények vagy hozzáadása akár 2% glükóz is javíthatja expresszió (13, 14). Ha gyanítható, hogy az expresszált fehérje mérgező a sejtekre (általában az IPTG-vel történő indukció után megáll a növekedés), próbáljon rövidebb ideig indukálni egy későbbi időpontban. Az IPTG koncentráció csökkentése egy másik lehetőség, amelyet meg kell vizsgálni.

10monitorozza a sejtek növekedését az optikai sűrűség leolvasásával 600 nm-en (A600). Egy éjszakai tenyészetnek el kell érnie az A600 ~1-1.2 értéket. A sejteket az E. coli logaritmikus növekedési görbéjének korai szakaszában kell indukálni, A600 ~ 0,5 – 0,7. Nál nél 37 C, kb 2 h, amíg a kultúrák elérik a növekedés korai naplófázisát. Ha a sejteket alacsonyabb hőmérsékleten termesztik, akkor az inkubációs időt meg kell növelni, mivel a sejtek alacsonyabb hőmérsékleten lassabban növekednek. Általában a fúziós fehérje legnagyobb hozama akkor érhető el, ha a sejteket A600 = ~ 0,5-nél indukálják. Az IPTG-vel történő indukció után az inkubációs időre vonatkozó általános iránymutatás a következő: 3 óra 37 Kb-on, 5 óra 30% – on, egy éjszakán át pedig 25% – on vagy annál alacsonyabb hőmérsékleten. A sejtek betakarítása a telítettség előtt, A600 ~ 1,0-1,2.

11a megfelelő levegőztetés biztosítása érdekében a lombikokat csak kapacitásuk 20-30% – áig szabad feltölteni.

12 fontos, hogy a mintában ne legyen szerin proteáz inhibitor a trombinnal vagy a XA faktorral történő hasítás előtt. A trombin vagy a Xa faktor hasítása előtt el kell távolítani a következő proteázgátlókat: AEBSF, APMSF, antitrombin III, antipain, 61-antitripszin, aprotinin, kimosztatin, hirudin, leupeptin és PMSF. Ezenkívül a pefabloc-TH benzamidin specifikus a trombinra,a Pefabloc FXa pedig a Xa faktorra. A következő proteázgátlókat kerülni kell a Preszcisiós proteáz alkalmazása esetén: 100 mM ZnCl2, 100 mm kimosztatin és 4 mM Pefabloc.

13számos alternatív módszer létezik a GST fúziós fehérjék kimutatására. A magas szinten jól expresszáló fehérjék esetében a tisztítás ellenőrzésének legegyszerűbb módja a Coomassie kék vagy ezüst folttal festett SDS-PAGE gélek. Az alacsony szinten expresszáló fehérjék alternatívája a Western blot használata a GST-re vagy a célfehérjére irányított antitest felhasználásával. A kis léptékű kifejezések alternatívája a GST jelenlétének figyelemmel kísérése ELISA vagy CDNB enzimvizsgálattal.

14 a tisztítás minden egyes lépéséből kis mennyiségű fehérjemintát kell menteni, beleértve a lízist, a felülúszót, a pelletet, a minta betöltéséből származó nem kötött frakciókat, a mosási lépéseket és az elúciós lépéseket, amelyeket SDS-PAGE vagy Western blot segítségével kell elemezni. Miután az összes mintát elemezték és összegyűjtötték, dobja ki a nem kívánt frakciókat.

15GST fehérjék is lehet tisztítani egy szakaszos tisztítási módszerrel. A kötegelt tisztítási módszer gyors, egyszerű, kevés felszerelést igényel; a kapott fehérje azonban több szennyeződést tartalmazhat, és alacsonyabb hozammal rendelkezik, mint a kromatográfián alapuló Tisztítás. A kötegelt tisztításokat a tisztítási körülmények szűrésekor lehet a legjobban felhasználni. Az alábbiakban vázolt szakaszos tisztítást általában szobahőmérsékleten végezzük. A proteolitikus degradáció kockázatának minimalizálása érdekében az eljárást 4 6CC-n hajthatjuk végre az inkubációs idő 2-4 – szeresének növelésével.

1. Lizáljuk a sejteket, és oldható fúziós fehérjét nyerjünk (lásd a 8.és 21. megjegyzést, ha a minta inklúziós testben van).

2. adjunk hozzá 2 ml 50% – os hígtrágya glutation-Szefaróz ömlesztett mátrixot (1 ml ágytérfogat) 100 ml bakteriális lizátum felülúszóhoz. Inkubáljuk 30 percig szobahőmérsékleten, enyhe keveréssel.

3. centrifugáljuk 500 g-ot 5 percig. Távolítsa el a felülúszót, és mentse az SDS-PAGE elemzéshez a kötés hatékonyságának meghatározásához.

4. mossa le a gyantát 10 ágy térfogatú PBS-vel. Óvatosan reszuszpendáljuk, majd centrifugáljuk 500 6g-ot 5 percig. Távolítsa el a felülúszót. Ismételje meg a mosási és centrifugálási lépéseket összesen 3, egyenként 10 ágy térfogatú mosásnál.

5. eluálja a fúziós fehérjét úgy, hogy a gyantát 1,0 ml glutation elúciós pufferrel / ml ágytérfogattal reszuszpendálja. Inkubáljuk 10 percig szobahőmérsékleten. Centrifugáljuk 500 g-ot 5 percig. Vigye át a fúziós fehérjét tartalmazó felülúszót egy külön csőbe. Ismételje meg az elúciós és gyűjtési lépéseket összesen 3 alkalommal. A felülúszók összegyűjthetők vagy SDS-PAGE-ben külön elemezhetők a fehérjetartalom ellenőrzése céljából (lásd a 12.megjegyzést).

a 16a ágy térfogata megegyezik a tisztításhoz használt 50% – os glutation-Szefaróz 4B szuszpenzió felével. 50% – os glutation-Szefaróz szuszpenzió elkészítéséhez (~75% – os szuszpenzióként kerül forgalomba): határozza meg a tisztítási skálához szükséges ágymennyiséget. Reszuszpendáljuk a glutation-Szefarózt 4B. a szükséges ágytérfogat minden milliliteréhez pipettázzunk 1,33 ml 75% – os szuszpenziót egy megfelelő méretű centrifugacsőbe. Centrifugáljuk 500 g-on 5 percig. Dekantálja a szuper. Mossuk le 10 ágytérfogattal (10 ml / 1,33 ml eredeti szuszpenzió) PBS-t úgy, hogy a csövet többször óvatosan megfordítjuk, hogy összekeverjük, majd centrifugáljuk 500 g-ot 5 percig. Dekantálja a szuper. Az etanol-tároló oldat eltávolításának elmulasztása zavarhatja a következő kötési lépéseket. Adjunk hozzá 1 ml PBS-t az eredeti szuszpenzió minden 1,33 ml-jéhez. Ez 50% – os szuszpenziót eredményez.

17a glutation-Szefaróz minimális kötőképessége 8 mg/ml. Egy 20 ml-es oszlopnak elegendőnek kell lennie a 3 600 ml-es E. coli tenyészetek fehérjetisztításához, amelyek tenyészetenként ~ 20-40 mg fúziós fehérjét tartalmaznak. Mind a felhasznált gyanta mennyisége, mind az oszlop mérete felfelé vagy lefelé méretezhető a tisztítandó fehérje mennyiségétől függően.

18felfüggesztjük a pelletet 25-50 6L / ml mosópufferrel eredeti tenyészet.

19a sejtbontás akkor fejeződik be, amikor a szuszpenzió részben kitisztul, és kissé sötétebb színűvé válik. Kerülje a habzást az ultrahangos kezelés során, mivel ez a fúziós fehérje denaturációjához vezethet. Kerülje a túlszonikációt, mivel ez a gazda E. coli fehérjék együttes tisztításához vezethet a GST fúziós fehérjével együtt. A nukleinsavak felszabadulása miatt a szonikáció során fellépő magas viszkozitás csökkenthető DNáz vagy benzoáz hozzáadásával a lízis pufferhez. Lizozim 0 koncentrációig.A sejtlízis elősegítésére 2 mg / ml adag adható. Az ultrahangos kezelés alternatívája a kereskedelemben kapható sejt-extrakciós készítmények alkalmazása. Ezek a termékek azonban tartalmazhatnak olyan szabadalmaztatott összetevőket, amelyek zavarják a későbbi alkalmazásokat.

20ha az expressziót az inklúziós testektől az oldható frakcióig próbálják eltolni, az oldhatatlan GST fúziós fehérjék néha denaturálószerek, például karbamid jelenlétében tisztíthatók, majd újraönthetők. A detergensek, például a sarkosyl (N-laurilszarozin) alkalmazásával történő szolubilizálást szintén sikeresen alkalmazták (15, 16). Bár a következő protokollt sikeresen alkalmazták a GST fúziós fehérjék denaturálására és újratermesztésére, minden egyes fúziós fehérje konstrukció egyedi, és a pontos denaturációs és újratermelési feltételeket empirikusan kell meghatározni. A sikeresen alkalmazott közös denaturálószerek közé tartozik a guanidin HCl, a karbamid, a Tween 20, a CTAB és az SDS (17, 18). A denaturálószereket ezután teljesen el kell távolítani, hogy lehetővé tegyék a fehérje megfelelő újraillesztését. Az újratöltés megkönnyítése érdekében optimalizálni kívánt feltételek a következők: a denaturálószer típusa, pH, redukálószer jelenléte, a denaturálószer eltávolításának sebessége és a fehérje koncentrációja. Miután a fehérje újra természetessé vált, ellenőrizze, hogy a fehérje visszanyerte-e natív konformációját és működését, és távolítsa el a nem megfelelően hajtogatott fehérjét.

1. a glutation-Szefaróz oszlopot előzetesen egyensúlyba hozzuk; szonizáljuk a pelletált E. coli sejteket, és centrifugálással különítsük el a lizátum felülúszó és pelletfrakcióit (lásd 3.3 A GST fúziós fehérje affinitás tisztítása 1-8.lépés). Az inklúziós testeket tartalmazó lizátum pelletet reszuszpendáljuk 15 ml-es mosópufferben. Centrifuga 20 perc 48.000 g (4 6c). A felülúszót dekantáljuk, majd a megmosott pelletet reszuszpendáljuk 12 ml U-pufferben(az eredeti tenyészet milliliterenként 20 ml u-pufferben reszuszpendáljuk). Inkubáljuk 2 óra jégen.

2. centrifuga 20 perc 48.000 g (4 6c). Vigye át a denaturált fúziós fehérjét tartalmazó felülúszót egy tiszta centrifugacsőbe.

3. adjunk hozzá Triton X-100-at a felülúszóhoz 1% – os végső koncentrációig.

4. Dializálja a mintát PBS / glicerinné 2-3 órán keresztül. a dialízis puffer térfogatának legalább a minta térfogatának 20-szorosának kell lennie.

5. Dializálja a mintát egy éjszakán át a PBS-hez képest proteáz inhibitorokkal, a minta térfogatának >100-szorosa puffertérfogat alkalmazásával.

6. vegye ki a mintát a dialízisből és centrifugálja 20 percig 4000 g-on.

7. az inklúziós testekből kivont és újrateremtett fehérje most alkalmazható a glutation-Szefaróz oszlopokra és tisztítható.

megoldások:

mosó puffer: 50 mM Tris, 5 mM EDTA, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatin, 0.15 mm PMSF, pH 8.0

U puffer: 5 M karbamid, 50 mM Tris, 5 mM EDTA,5 mM 2-ÉN, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatin, 0.15 mM PMSF, 1 mM DFP pH 8.0

PBS/glicerin: 1X PBS, 20% – os glicerin, 1% Triton X-100, 5 mM 2-ÉN, 5 mM EDTA, 5 mM 2 – ÉN, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatin, 0.15 mM PMSF, 1 mM DFP pH 7.4

21Use a perisztaltikus szivattyú tanácsoljuk, hogy egyenletesen control flow árak. Ha a gyanta összenyomódik, a nyomás túl magas, és az áramlási sebességet csökkenteni kell.

22a glutation és a GST közötti kötési kinetika viszonylag lassú. Ezért fontos, hogy alacsony áramlási sebességet használjunk a maximális kötőképesség eléréséhez, pl. 0,1 ml / perc egy 2,5 cm-es I. D. oszlop esetében. A túl gyors áramlási sebességek használata csökkentheti a kötött fúziós fehérje mennyiségét az asszociáció lassú kinetikája miatt. Az időmegtakarítás érdekében a mosási és elúciós lépéseket gyorsabb áramlási sebességgel lehet elvégezni (1,5 ml/perc, illetve 0,3 ml/perc). Nagy térfogatú minták esetén a kötést a legkényelmesebben egy éjszakán át hajtják végre, az áramlási sebességek beállításával úgy, hogy az oszlop ne száradjon ki.

23a nem kötött frakciók elemzése jelzi, hogy a fúziós fehérje kötődik-e vagy sem. Ha a fehérjét nem detektálják a korai frakciókban, de későbbi frakciókban jelenik meg, ez azt jelzi, hogy az oszlop kapacitását túllépték. A fehérjeterhelés csökkentése vagy az oszlop méretének növekedése enyhíti ezt az állapotot.

24ha a fúziós fehérje rosszul kötődik a glutation-Szefarózhoz, számos alternatíva létezik a kötési hatékonyság növelésére. Próbáljon ki egy enyhébb lízis módszert. Ha az alkalmazott módszer túl kemény, a fehérje denaturálódhat, ezért nem képes kötődni az oszlophoz. Továbbá, ha a fehérjét újratermesztik a befogadó testekből, győződjön meg arról, hogy az összes denaturálószert eltávolították a pufferből, akár kimerítő dialízissel, akár a minta sótalanító oszlopra történő felvitelével, mielőtt a glutation oszlopra alkalmaznák. Távolítsa el az etanol tároló oldatot a glutation-Szefarózból; csökkentse az oszlopot friss glutation-pufferrel, majd közvetlenül a minta betöltése előtt mossa le PBS-sel. Növelje a gyanta mennyiségét és / vagy csökkentse a minta betöltéséhez használt áramlási sebességet. Próbáljon hozzá 1-20 mM DTT-t a mintához. Ha a probléma továbbra is fennáll, tisztítsa meg az oszlopot a gyártó ajánlása szerint. Ha a kötés még mindig nem áll helyre, próbáljon friss gyantát használni.

25A fúziós fehérje hozama 280 nm-es abszorbancia mérésével is becsülhető (A280). Csak a GST-rész kihalási együtthatója ~ 1,5, azaz 1,00 A280 = ~ 0.6 mg/ml fehérje, bár a fúziós fehérje kihalási együtthatója részben függ a célfehérje abszorbanciajellemzőitől.

26HA probléma merül fel a fehérje eluálásával a glutation-Szefaróz oszlopból, próbálja meg csökkenteni az áramlási sebességet és növelni az alkalmazott elúciós puffer térfogatát. Ügyeljen arra, hogy friss redukált glutation puffert használjon (legyen az a nap, amikor használni fogják). Növelje a glutation koncentrációját 40 mM-ig és / vagy emelje a puffer pH–ját 8,0-9,0 pH-ra. Adjon hozzá 1-20 mM DTT-t (vagy más redukálószert) a pufferhez. Nemionos mosószer hozzáadása szintén javíthatja az oldódást és minimalizálhatja az esetlegesen előforduló aggregációt.

27a tisztított fúziós fehérje E. coli gazdasejt-fehérjékkel való szennyeződése azt jelzi, hogy az ultrahangos kezelés túl súlyos volt. Ha a fúziós fehérje lebomlott fragmensei vannak jelen, próbáljon további proteázgátlókat adni a lízis pufferhez. Tartsa hidegen az összes mintát, puffert és gyűjtőcsövet a proteolízis minimalizálása érdekében. Ha a fehérje expressziója során lebomlás következik be, próbálja meg későn indukálni a mintát (~0.8 OD600), és csökkentse az indukciós periódus hosszát. Váltás egy alternatív gazda törzs is segíthet.

28az oldatban történő emésztés alternatívája a fúziós fehérje proteázhasítása, miközben a glutation-Szefaróz mátrixhoz kötődik. A fúziós fehérjét extraháljuk és a glutation-Szefarózra töltjük, majd PBS-sel mossuk (lásd a GST fúziós fehérje affinitás tisztítása, 1-11. lépés). Ahelyett, hogy a fehérjét glutation pufferrel eluálnák, az enzimet tartalmazó PBS-oldatot töltjük az oszlopra, és szobahőmérsékleten több órán át inkubáljuk (4 db C Preszcisiós proteáz esetében). A hasított fehérjét ezután több oszloptérfogatú PBS-sel mossuk ki az oszlopból. A maradék fúziós fehérje és a GST-rész az oszlopból redukált glutation pufferrel történő mosással távolítható el. Az enzim mennyiségét és az inkubációs időt empirikusan meg kell határozni minden egyes fúziós fehérje esetében. Elemezze az összes mintát SDS-oldal szerint a hasítási hatékonyság és a fehérje tisztaságának meghatározásához.

29 szakaszos proteázhasítás esetén empirikusan meghatározott mennyiségű enzimet kell hozzáadni a gyantához kötött fúziós fehérjéhez (lásd a 15.A–d megjegyzést). Használjon 1 ml PBS-tartalmú enzimet az ágy térfogatának ml-ében. Inkubáljuk szobahőmérsékleten néhány órán át enyhe keveréssel. Centrifugáljunk 500 g-ot 5 percig, hogy a gyantát üledékbe ültessük. Távolítsa el a szuper amely tartalmazza a célfehérjét egy külön csőbe. A hasadt fúziós fehérje visszanyeréséhez a glutation-Szefarózt legfeljebb 3-szor mossuk PBS-sel. Inkubáljuk a gyantát glutation pufferrel, hogy eltávolítsuk a GST-t és a maradék fúziós fehérjét. Használjon 1 ml glutation puffert egy ml gyantára. Centrifugáljunk 500 g-ot, és állítsuk vissza az eluált GST-t. Ismételje meg akár 3-szor. Elemezze a mintákat SDS-oldal szerint.

30ha trombinproteázt alkalmazunk, az emésztést a fehérje oszlopból történő eluálására használt glutation pufferben lehet elvégezni. Xa faktor alkalmazása esetén az emésztés előtt ajánlott a fehérjét Tris pufferbe vagy PBS pufferbe dializálni; az elúciós pufferben jelen lévő glutation megzavarhatja a XA Faktorban jelen lévő diszulfidhidakat, ami a fúziós fehérje nem hatékony emésztéséhez vezet. Kísérleti emésztési kísérlet során meg kell határozni az egyes fúziós fehérjék emésztési körülményeinek empirikus meghatározását. Egy kényelmes módszer az, hogy megemészteni 100 Ft fúziós fehérje egy sor enzim-szubsztrát arányok és változik a lappangási idő. A tipikus inkubációs idő 2-8 óra. a trombin ajánlott enzim-szubsztrát aránya a következő 1:100, 1:350, 1:1000, és 1:3000 (enzim egység / a fúziós protein hektolitere), és az Xa faktor esetében a következők 1:10, 1:25, 1:50, 1:100, 1:300 ((a fúziós proteinre vonatkozóan). A kívánt időpontokban távolítsunk el 2 6G proteint, és állítsuk le az emésztést úgy, hogy a minta alikvot-ját hozzáadjuk a forrásban lévő SDS mintapufferhez. Elemezze a mintákat SDS-oldallal az optimális hasítási feltételek meghatározásához. Az enzim / szubsztrát arány és idő mellett fontolja meg a pufferfeltételek megváltoztatását, például a NaCl-koncentráció növelését vagy csökkentését vagy a Ca2+ hozzáadását a pufferhez (a hibaelhárítási tippeket lásd a 31.megjegyzésben).

31ha az emésztés után a célfehérje SDS-oldalán több sávot észlelnek, ellenőrizze a célfehérje szekvenciáját a potenciális másodlagos proteázfelismerő helyek szempontjából. Ha léteznek másodlagos hasítási helyek, klónozzon újra egy másik vektorba. Ha nem észlelhető hasadás, ellenőrizze a DNS-szekvenciát, hogy ellenőrizze a proteáz várható hasadási helyének jelenlétét és integritását. Győződjön meg arról, hogy a proteázgátlók teljesen eltávolításra kerültek a pufferből. Adjon hozzá több enzimet és / vagy növelje az inkubációs időt egy éjszakára. Ha az emésztés a legmagasabb enzim / szubsztrát aránynál és a leghosszabb időpontoknál nem teljes, fontolja meg a proteáz hasítási helyének újratervezését úgy, hogy a GST-rész és a célfehérje között több glicin is szerepeljen, hogy csökkenjen a hasadást zavaró szterikus akadály valószínűsége (19, 20).

32 ha az enzim gátlása az emésztés befejezése után szerin proteázgátlókkal nem kívánatos, a mintát HiTrap benzamidin oszlopra lehet felhordani az enzim mintából történő eltávolítása céljából.

33 ha a mintát újra kromatográfiával kell ellátni a glutation-Szefaróz oszlopon, hogy eltávolítsák a GST-t és az emésztetlen fúziós fehérjét, kritikus fontosságú, hogy a redukált glutationt teljesen eltávolítsák a mintából. A glutation nagyon lassan egyensúlyba kerül a dialízis membránokon; ezért ha mwco <12 000 értékű dialíziscsövet használnak, 3 vagy több puffercserére lehet szükség a teljes eltávolításhoz. Megnövelt dialízis idő (egy éjszakán át) és nagyobb mennyiségű puffer is szükséges lehet nagy mintamennyiség esetén.

34ugyanaz a glutation-Szefaróz oszlop használható mind a fúziós fehérje kezdeti izolálására, mind az enzimes hasítás utáni repurifikációra. A különböző rekombináns fehérjék esetleges keresztszennyeződésének elkerülése érdekében ajánlott egyetlen oszlopot külön fehérje konstrukciónak szentelni. Az oszlopok többször is felhasználhatók. Ha a kötési hatékonyság idővel csökken, tisztítsa meg az oszlopot a gyártó ajánlásainak megfelelően. Ha a kötési tevékenység nem áll helyre, új oszlopot kell használni.

35maximális kötés következik be, ha az oszlop teljesen csökken; ha azonban a glutation-Szefaróz oszlopot e lépés előtt kevesebb, mint 48 órával mostuk, ezt a lépést kihagyhatjuk.

36a célfehérje a nem kötött frakcióban lesz, és a GST és a hasítatlan fúziós fehérje kötődik az oszlophoz.

37kis mintamennyiség ajánlott a célfehérje más szennyező anyagokkal szembeni jó felbontásához. Ha a minta kis térfogatra történő koncentrálása nem kivitelezhető, a minta többszöri befecskendezése is elvégezhető.