PMC

a CPV-2 a kutyák vírusos gastroenteritisének fő etiológiai kórokozója. A Parvoviridae család tagja, amely a protoparvovírus nemzetséghez és az 1. típusú Protoparvovírus fajhoz tartozik. Ez egy nem burkolt vírus, egyszálú DNS-genommal, amely két kapszidfehérjét, a VP1-et és a VP2-t kódolja, amelyek a vírusgenom összeállításához és csomagolásához szükségesek, valamint az NS1 és NS2 nem szerkezeti fehérjéket, amelyek a DNS replikációjának szabályozásában, a gének expressziójának összeállításában és szabályozásában segítenek .

az elmúlt években a CPV-2 új antigén variánsokat fejlesztett ki. 1980-ban a CPV-2 eredeti törzsét felváltotta a 2A típusú változat (CPV-2a), 1984-ben a CPV-2b-t azonosították,2001-ben pedig a CPV-2C-t észlelték és jelentették Olaszországban. Az utóbbi változatot Ázsiában, Afrikában és Amerikában is azonosították. A CPV-2 több antigén variánsa miatt a klinikai tünetek nagymértékben változhatnak .Ezt követően az állatorvosok kevésbé bizonyosak az előzetes diagnózisuk kiadásakor, és általában bizonyos laboratóriumi vizsgálatokra van szükség annak érdekében, hogymegerősítik diagnózisukat; bár számos technikát fejlesztettek ki kutatólaboratóriumokban, például hemagglutinációs vizsgálatokat, immunfluoreszcenciát, ELISA-t,PCR-t, immunkromatográfiás tesztet és sejttenyészetet (többek között), valójában az állatorvosi kórházak klinikai laboratóriumaiban a legnagyobb rendelkezésre állású technikák csak az immunkromatográfiás teszt és a PCR, azonban ezen eljárások érzékenységével és specifitásával kapcsolatos kutatások során a jelentések ellentmondásosak.Továbbá, a különböző fokú betegség súlyosságú betegeknél ezeknek a technikáknak az érzékenységét és specifikusságát nem vizsgálták széles körben.

a vizsgálat célja az immunkromatográfiás teszt és a PCR által kínált előnyök és hátrányok jelentése azon betegek diagnosztizálására, akik a CPV-2 klinikai tüneteinek széles változatosságát mutatják.

ezt a vizsgálatot a Mexikói hivatalos Norm Nom-062-ZOO-1999 kísérleti állatkísérletek irányelvei szerint végezték.

klinikai bélgyulladásban szenvedő, az Universidad AUT Enterprises de Estado de M Enterprises Állatorvosi kórházában kórházba került kutyákat szűrtük erre a vizsgálatra, és a tesztelt pozitív vagy negatív CPV-2 alapján kiválasztottuk beágyazott PCR (nPCR) alkalmazásával. Ennek eredményeként 45 pozitív teszttel rendelkező kutyát választottak ki, 5 negatív teszttel rendelkező kutyát pedig kontrollként vettek be. Az 50 kutyát három állatorvos egyidejűleg klinikailag megvizsgálta, hogy megkapja a klinikai diagnózis érzékenységét. Mindegyik állatorvos diszkrét módon adta ki feltételezett diagnózisát, diagnosztikai eszközként a problémaorientált állatorvosi nyilvántartást (POVMR) használva.

ezután az összes kutya székletmintáit PCR és immunkromatográfiás teszttel elemezték, míg a vérmintákat a teljes vérkép elvégzéséhez használták.

az nPCR-t rendkívül megbízható és érzékeny technikának tekintik a CPV-2 vírusrészecskék azonosítására , ezért ebben a vizsgálatban az alkalmazott tesztek érzékenysége korrelált az nPCR-től korábban kapott CPV-2diagnózissal.

a kutya székletmintáit rektális tamponokkal nyertük, amelyeket nukleázmentes vízben és 200 ml homogenátban szuszpendáltunk, és fordns extrakciót használtunk. Az eljárást a QIAamp DNS széklet DNS extrakciós készletével (QIAGEN, Mainz, Németország) hajtottuk végre, a gyártó utasításait követve. Az összes DNS-mintát q5000 Quawell spektrofotométerrel (Quawell Technology, Inc., San Jose, CA, USA). Minden mintából 100 ng DNS-t használtunk PCR-reakciókhoz, 50 6L végső térfogattal. Korábban laboratóriumunkban egy primerpárt terveztek egy 275 bp fragmentum, ParvoInt2FB (5′-TCAAGCAGATGGTGATCCAAG-3′) és ParvoInt2CR (5′-GGTACATTATTTAATGCAGTTA-3′) amplifikálására,amely a VP2 gén 1,107–1,130 és 1,360–1,382 nukleotidjain található (GenBankaccession number fj0051962c).

a PCR-reakciókat úgy végeztük, hogy minden primerből 2 db (200 nM), DNS-polimerázt tartalmazó Gotaq 12,5 db (Promega, Madison,WI, U. S. A.) Zöld mesterkeveréket, reakciópuffert (pH 8,5) és 400 db nukleotidot (dATP, dGTP, Dctp és dTTP) használtunk; 3 mM MgCl2-t.és 28.5 db nukleázmentes víz. Az összes reakciót a következő amplifikációs körülmények között hajtottuk végre; 1 ciklus 94 Kb-n 5 percig a kezdeti denaturáláshoz, majd 35 ciklus 94 Kb-n 30 másodpercig, 52 Kb-n 1 percig, 72% – on 1 percig, majd egy végső hosszabbítási ciklus 72% – on 5 percig.

az nPCR-t kezdetben 1740 bp fragmentum amplifikálásával végezték ParvoExt1f (5′-ATGAGTGATGGAGCAGTTCA-3′) és ParvoExt3R (5′-AGGTGCTAGTTGAGATTTTTCATATAC–3′) primerek alkalmazásával,és a VP2 génből származó 1-20 és 1712-1740 nukleotidszekvenciák felhasználásával tervezték kutyákra parvovírus (GenBank csatlakozási szám fj0051962c). A reakciótstandardizálták, hogy a végtérfogata 50 6L legyen.

A reakció mix tartalmaz 1 µl GoTaq® Flexi DNS-Polimeráz 5 U/µl (Promega), 5 µl GoTaq® Flexi puffer 5XGreen, 3 µl 25 mM MgCl2-ot, 4 µl dNTP 200 µM-es, 2 µl alapozók, 10µl a DNS-t, egy végső koncentrációja 100 ng 23 µl nuclease szabad víz. A reakciót a következő amplifikációs körülmények között hajtottuk végre: 1 ciklus 94 Kb-N 5 percig, majd 35 ciklus 94 Kb-n 30 másodpercig, 50 kb-n 45 másodpercig, 72 dB-on 1 percig, majd 1 ciklus 72 db-On 5 percig. Ezt követően ennek a reakciónak a termékéből 1 6L-t használtunk DNS-sablonként a fészkelési eljáráshoz, és a primerek és az amplifikációs feltételek azonosak voltak a 275 bp fragmentum esetében.

az összes amplifikációs terméket vízszintes elektroforézissel azonosítottuk 2% – os agarózgélben, 0,5 ~ g/ml etidium-bromiddal festve, és UV transzilluminátorral vizualizáltuk.

a kutya parvovírus (CPV Ag) immunkromatográfiás vizsgálatának elemzéséhez az ANIGEN GmbH kit (Bionote Inc., Gyeonggi-do, Korea) használták. Minden vizsgálatot a gyártó utasításai szerint hajtottak végre.

vérmintákat vettünk a nyaki vénából vacutainer csövek alkalmazásával, antikoagulánsként EDTA-val. A teljes vérsejtszámot (CBC) anautomatizált sejtszámlálóval végeztük (QBC vet-IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, én, USA). A vérfilmeket Wright-Giemsa-val festették, és fotonmikroszkóp alatt vizsgálták. A leukopeniát akkor vették figyelembe, amikor a teljes CBC-szám kevesebb volt, mint 6 db 103/ml .

az eredmények elemzését kódolt változók mátrixának felhasználásával végeztük, és készenléti táblázatokat hoztunk létre a diagnosztikai teszt tulajdonságainak meghatározására . Ezenkívül a Kappa statisztikát úgy határoztuk meg, hogy megbecsüljük a három használt teszt és az nPCR közötti egyezést. A kappa-értéket Kantere és munkatársai 2015-ben jellemezték, ahol az 1-es Kappa-érték abszolút megegyezést jelez, míg a 0-as érték azt jelzi, hogy a megegyezés a véletlen miatt következik be. Általában a 0,6-nál magasabb Kappa-értékek jó megállapodási szintet jeleznek; az elemzést az SPSS ver statisztikai csomag felhasználásával végeztük. 22.0 (IBM, Inc., Armonk, NY, USA).

kilencven egy pont egy (91,1) % -a pozitív kutyák CPV-2 által npcr volt fajtatiszta; 95.A betegek 5% – a két-nyolc hónapos, 4,5% – a pedig egy évnél idősebb volt. Oltási státuszukat tekintve 40% – ot legalább egyszer beoltottak a CPV-2 fertőzés megelőzése érdekében.

ezeknek a kutyáknak a klinikai tüneteinek gyakorisága a következő volt: 44,4% – UK hányást és hasmenést mutatott; 20% – uk lázas, hányás és hasmenés volt(katarrális vagy vérzéses); 17,7% – UK csak hasmenést mutatott; 8,8% – UK csak hányást mutatott; 4,4% – UK hasmenést és lázat mutatott, 4,4% – uk pedig hányást és lázat mutatott.Leukopeniát a kutyák 48,8% – ánál figyeltek meg (1.táblázat).

klinikai vizsgálat során az állatorvosok a CPV-2–re pozitív betegek mindössze 57,8%–át, a negatív kutyák 100% – át diagnosztizálták; ezért a klinikai diagnózis érzékenységi értékét 57,7% – ra becsülték (CI0, 95 42, 2-72), és a megfigyelt specificitás 100% volt (CI0, 95 46, 2-98, 8).

ami a laboratóriumi vizsgálatok diagnózisát illeti, az nPCR révén pozitív eredményt mutató kutyák 100%-A közül ezeknek a betegeknek csak 30/45 volt CPV-2 pozitív az immunokromatográfiás teszten keresztül, míg az öt kontroll beteget, akiknél a CPV-2 negatív volt, helyesen diagnosztizálták. Ezért ez a technika 66,6% – os érzékenységet mutatott (CI0, 95 50, 9–79, 5), és a megfigyelt specifitás 100% volt (CI0, 95 46, 2–98, 8).

PCR technikával 36/45 beteg volt pozitív a CPV-2-re, és az öt kontroll beteg negatív volt az nPCR egész ideje alatt. Így a PCR 80%–os érzékenységet (CI0, 95 63, 1–87, 7) és 100% – os specifitást (CI0, 95 67, 8-99, 1) mutatott (ábra. 1).

a három technika közötti egyezést A Kappa-érték mutatja (2. táblázat).

a CPV-2 által okozott Gastroenteritis az egyik legfontosabb vírusos betegség, amely a kutyákat érinti. Bár a kutya parvovírus fertőzés klinikai tünetei változhatnak, a leggyakoribb tünetek a következők voltak: anorexia, depresszió, letargia ,láz, mucoid és hemorrhagiás hasmenés és leukopenia ; szubklinikai esetekben ezek közül a jelek közül néhány jelen lehet vagy nem .

a klinikai vizsgálat során a fertőzés klinikai megnyilvánulásainak variabilitását figyelték meg. A vizsgált kutyáknak csak 20% – a mutatta be a tipikus jeleket, mint általánosanaz irodalomban leírtak szerint. A betegség klinikai változékonyságáról korábban beszámoltak, és egyes szerzők lehetséges okként olyan tényezőket tárgyaltak, mint az életkor, az immunrendszer állapota, Az expozíció módja, a vírus dózisa, a törzsek virulenciája és más fertőző ágensekkel való egyidejű fertőzés . Ez megnehezíti a CPV-2 pontos diagnózisának megszerzését, amikor az állatorvosok kizárólag klinikai vizsgálatukra támaszkodnak. Ezért a miénkkizárólag ezen eljárás alapján végzett vizsgálat, a kutyák 42,2%-ának hamis negatív CPV-2 diagnózisa lesz.A kutyák orvosi feljegyzésein keresztül ebben a tanulmányban megfigyeltük, hogy az állatorvosok elsősorban azért zárják ki a fertőzés lehetőségét, mert a kutyák nem mutatták a szakirodalomban leírt klasszikus klinikai tüneteket, CPV-2 ellen vakcináztak és/vagy felnőttek voltak. A vizsgálatunkban szereplő kutyák többsége azonban atipikus jeleket mutatott. Ezért úgy gondoljuk, hogy a CPV-2 szubklinikai fertőzései gyakoribbak, és az állatorvosoknak, akiknek el kell dönteniük, hogy alkalmaznak-e további, nagy érzékenységű és specificitású diagnosztikai vizsgálatokat, komolyan mérlegelniük kell ezeket az eredményeket.

ebben a vizsgálatban a CVP-2-re pozitív betegek 40% – át korábban immunizálták. Jól ismert, hogy a PCR technika nagyon érzékeny, ezért észlelivakcinás vírusrészecskék a közelmúltban vakcinázott betegek székletében; a vizsgálatok azt mutatják, hogy hamis pozitív eredményeket lehet elérni a 3-10 .naptól a vakcinázás után módosított élő CPV vakcinával. Következésképpen, hogy elvégezzükezt a vizsgálatot kizárták azokat a betegeket, akiknek az előző 15 napban vakcináztak. Ezenkívül a beoltott kutyák CPV-2-re pozitív mintáit szekvenálták,és minden vizsgált esetben a genovariáns CPV-2C-t azonosították (az adatok nem mutatják), ami azt jelenti, hogy a kutyák fertőzöttek voltak a terepi CPV-2C-vel, tudva, hogy Mexikóban még nem áll rendelkezésre CPV-2cv-oltás. Mexikóban Pedroza és munkatársai arról számoltak be, hogy a fertőzött kutyák leggyakoribb antigénváltozata a CPV-2C volt .

másrészt sok állatorvos figyelembe veszi a leukopenia jelenlétét, amely a CPV-2 diagnózis támogató tényezője. Megfigyeltük azonban, hogy csak 48.A vizsgált kutyák 8% – a (22/45) leukopeniát mutatott az értékelés során, ami összhangban van más jelentésekkel, amelyek azt mutatták, hogy a kutyák körülbelül 50% – a nem mutat hematológiai elváltozásokat az értékelés idején . Ezért a CBC értékes eszköz, amely információt szolgáltathat a betegség súlyosságáról, ami prognózist javasol és meghatározza a kezelésre adott választ. A leukopeniát azonban nem szabad a CPV-2 diagnosztikai eszközének tekinteni,mivel nem nyújt bizonyítékot a vírus jelenlétére.

a VÍRUSAZONOSÍTÁS különböző technikáit használják a CPV-2 fertőzés végleges megerősítésére, például az immunkromatográfián alapuló gyors teszteketa klinikusok széles körben használják, mivel az eljárás egyszerű, gyors és hozzáférhető. Ezenkívül nem igényel minta előkészítést vagy specializedlaboratory-nak történő elküldést elemzésre. Ennek a tesztnek a változó érzékenysége hátránya; számos tanulmány kimutatta , hogy érzékenysége 50-100% között mozog, vizsgálatunkban pedig az npcr-rel való összehasonlító érzékenység 66,6% volt. Egyes tanulmányok azt sugallják, hogy az alacsony technika érzékenysége annak köszönhető, hogy nagy vírusrészecskék mennyiségeket kell a kutyák székletébe önteni, hogy pozitív diagnózist kapjunk . Ennek a technikának a használatát újra kell gondolni, mivel a hamis negatív eredmények nagyobb valószínűsége várható. Ennek megakadályozása érdekében további, nagyobb érzékenységű technikákat kell alkalmazni .

számos tanulmány bizonyította a PCR – alapú tesztek nagy érzékenységét; jelenleg ugyanazon eljárás több változata létezik, amelyek érzékenységet kínálnak80-tól 100% – ig terjed . Ebben a tanulmányban a PCR 80% – os érzékenységgel rendelkezett, és érdemes megemlíteni, hogy a betegek csak pozitív fertőzéseket azonosítottak az nPCR-en keresztül, miközben sem a PCR, sem az immunkromatográfiás tesztek nem tudták azonosítani.

a kappa-érték tekintetében összehasonlítottuk a három elemzett módszer eredményeit az nPCR-rel. Mindazonáltal a klinikai diagnózis és az npcr közötti gyenge egyezést igazolták; mérsékelt egyezést figyeltek meg a hagyományos PCR és az nPCR között, ami a két teszt hasonlóságának tudható be.

a klinikai tüneteket illetően hányás vagy hasmenés jelenlétét figyelték meg minden vírussal fertőzött betegnél, míg más klinikai tüneteket nem tekintettek relevánsnak a fertőzés szempontjából; a klinikai tünetekkel és az alkalmazott technikák érzékenységével összhangban nem figyeltek meg összefüggést. Például a 26.eset csak hányást mutatott klinikai tünetként, és az állatorvosi klinikai diagnózis negatívnak ítélte a CPV-2-t, azonban az immunkromatográfiás teszt, a PCR és az npcrtesztek pozitívak voltak a CPV-2-re. Továbbá a 41.és 42. esetben, amikor a fő klinikai tünet a hasmenés volt, csak CPV-2-re pozitív npcr-t lehetett diagnosztizálni.

adataink azt mutatják, hogy a klinikai és diagnosztikai állatorvosi laboratóriumokban a CPV-2 kimutatására leggyakrabban használt diagnosztikai tesztek nagyon specifikusak, de hiányzik az érzékenység, ami megakadályozza a CPV-2 pontos diagnosztizálását. Vizsgálatunkban a PCR és az immunkromatográfiás teszt nem volt olyan érzékeny, mint az nPCR , amit a korábbi vizsgálatok is megerősítettek, azonban az npcr diagnosztikai tesztként történő használata még nem terjedt el széles körben az állatorvosi kórházakban,miközben továbbra is széles körben használják kutatási célokra.

másrészt, a valós idejű PCR, amely szintén nagyon érzékeny, ritkán használják, mert a magas berendezések költségei és a követelmény egy magasan specializált személyzet kezelése. A technológiai fejlődés azonban lehetővé tette, hogy ezek a technikák olcsóbbá és egyszerűbbé váljanak, ami az állatorvosi kórházakban történő közvetlen alkalmazásukhoz vezethetett a CPV-2 diagnosztikai pontosságának javítása érdekében.