Protein purificationEdit
a Polihisztidin-tageket gyakran használják az Escherichia coliban és más prokarióta expressziós rendszerekben expresszált polihisztidin-tagged rekombináns fehérjék affinitásának tisztítására. A baktériumsejteket centrifugálással nyerik ki, és a kapott sejtpelletet fizikai eszközökkel vagy mosószerekkel és enzimekkel, például lizozimmal vagy ezek bármely kombinációjával lizálják. Ebben a szakaszban a nyers lizátum a rekombináns fehérjét tartalmazza a bakteriális gazdaszervezetből származó sok más fehérje között. Ezt a keveréket affinitásgyantával inkubáljuk, amely kötött kétértékű nikkel-vagy kobaltionokat tartalmaz, amelyek kereskedelmi forgalomban különböző fajtákban kaphatók. A nikkel és a kobalt hasonló tulajdonságokkal rendelkezik, és mivel szomszédos 4.periódusú átmeneti fémek (v. vas-triád). Ezek a gyanták általában szefaróz/agaróz kelátképzővel funkcionalizálódnak, például iminodiecetsavval (Ni-IDA) és nitrilotriecetsavval (ni-NTA) a nikkel és karboxil-metil-aszpartáttal (Co-CMA) a kobalt esetében, amelyhez a polihisztidin-tag mikromoláris affinitással kötődik. Ernst Hochuli et al. 1987-ben az NTA ligandumot és a Nikkelionokat agarózgyöngyökhöz kapcsolták. A gyantát ezután foszfátpufferrel mossuk, hogy eltávolítsuk azokat a fehérjéket, amelyek nem specifikusan kölcsönhatásba lépnek a kobalt-vagy nikkelionnal. Ni-alapú módszerekkel a mosási hatékonyság javítható 20 mM-es imidazol hozzáadásával (a fehérjéket általában 150-300 mM-es imidazollal eluálják). Általában a nikkel alapú gyanták nagyobb kötési kapacitással rendelkeznek, míg a kobalt alapú gyanták a legnagyobb tisztaságot nyújtják. A fehérje tisztasága és mennyisége az SDS-PAGE és a Western blot segítségével állapítható meg.
affinitás Tisztítás polihisztidin-tag alkalmazásával általában viszonylag tiszta fehérjét eredményez, ha a rekombináns fehérjét prokarióta organizmusokban expresszálják. A downstream alkalmazásoktól függően, beleértve a fehérjekomplexek tisztítását a fehérje kölcsönhatások tanulmányozására, a magasabb organizmusoktól, például élesztőktől vagy más eukariótáktól való tisztítás tandem affinitás-tisztítást igényelhet két címke alkalmazásával a nagyobb tisztaság elérése érdekében. Alternatív megoldásként az egylépéses Tisztítás immobilizált kobaltionokkal, nem pedig nikkelionokkal általában jelentősen növeli a tisztaságot, és alacsonyabb imidazol-koncentrációt igényel a HIS-tagged fehérje elúciójához.
a Polihisztidin-címkézés a rekombináns fehérjék denaturálási körülmények közötti tisztítására választható lehetőség, mivel hatásmechanizmusa csak a fehérjék elsődleges szerkezetétől függ. Például, még akkor is, ha egy rekombináns fehérje erőszakkal expresszálódik E. a coli inklúziós testet termel, és nem oldható fehérjeként nyerhető, karbamiddal vagy guanidin-hidrokloriddal denaturálva tisztítható. Általában az ilyen típusú technikáknál a hisztidin kötését az imidazol kötés helyett pH-val titrálják—magas pH-nál a hisztidin kötődik a nikkelhez vagy a kobalthoz, de alacsony pH-nál (~6 a kobalthoz és ~4 a nikkelhez) a hisztidin protonáltvá válik, és a fémiontól versenyez. Hasonlítsuk össze ezt az antitest tisztítással és a GST tisztítással, amelynek előfeltétele az érintett fehérjék megfelelő (natív) hajtogatása. Másrészt azt mondják, hogy a HIS címke inkább aggregálódik és insolubilizálódik, mint más affinitási címkék.
a Polihisztidin-tag oszlopok számos jól ismert fehérjét tartalmaznak szennyeződésként. Az egyik az FKBP típusú peptidil-prolil izomeráz, amely 25kda (SlyD) körül jelenik meg. A szennyeződéseket általában szekunder kromatográfiás technikával távolítják el, vagy a rekombináns fehérjét slyd-hiányos E. coli törzsben expresszálják. Alternatív megoldásként, összehasonlítva a nikkel-alapú, kobalt-alapú gyanták kisebb affinitással rendelkeznek az E. coli SlyD-jével, de több esetben mérsékelten hasznos.
az egyik elválasztása két polihisztidin címkétől
a különböző számú polihisztidin címkével rendelkező fehérjék eltérően eluálódnak, mint a nikkel-affinitás gyanta. Az egyetlen hexahistidin címkével rendelkező fehérjék esetében a 75 mM-es imidazol lehetővé teszi a Ni-NTA-ból történő elúciót, míg a két hexahistidin címkével rendelkező fehérjék esetében az elúcióhoz 100 mM-es imidazol szükséges. Ez a lépésenkénti elúció felhasználható specifikus fehérje-összeállítások izolálására egy keverékből, például meghatározott heteromultimerekből (pl. AB heterodimer az AA és BB homodimereket tartalmazó keverékből, ha csak a B alegységnek van polihisztidin címkéje). Ezt a megközelítést alkalmaztuk a monovalens sztreptavidin izolálásakor.
kötési vizsgálatokszerkesztés
a Polihisztidin-címkézés ugyanúgy használható a fehérje-fehérje kölcsönhatások kimutatására, mint a lehúzási vizsgálat. Ezt a technikát azonban általában kevésbé érzékenynek tekintik, és ennek a technikának néhány finomabb aspektusa is korlátozza. Például redukáló körülmények nem használhatók, EDTA és sokféle mosószer nem használható. A kettős polarizációs interferometria legújabb fejleményei alkalmasak az EDTA-ra és a reagensek szélesebb körű használatára, és az ilyen helyspecifikus címkék használata nagyban leegyszerűsíti a kapcsolódó konformációs változások közvetlen mérését.
fluoreszkáló címkékszerkesztett
Hexahistadine CyDye címkéket is kifejlesztettek. Ezek nikkel-kovalens koordinációt alkalmaznak a fluoroforokhoz kapcsolódó EDTA-csoportokhoz annak érdekében, hogy színezékeket hozzanak létre, amelyek a polihisztidin címkéhez kapcsolódnak. Ez a technika hatékonynak bizonyult a fehérjemigráció és-kereskedelem nyomon követésében. A közelmúltban olyan felfedezések is voltak, amelyek azt mutatják, hogy ez a technika hatékony lehet A távolság mérésére fluoreszcens rezonancia energiaátadás útján.
egy polifluorohistidin taget jelentettek in vitro transzlációs rendszerekben történő alkalmazásra. Ebben a rendszerben kiterjesztett genetikai kódot alkalmaznak, amelyben a hisztidint 4-fluorohistidin váltja fel. A fluorozott analóg a hisztidin-tRNS ligáz relaxált szubsztrát specificitásán keresztül beépül a peptidekbe, és csökkenti a tag teljes pKa-ját. Ez lehetővé teszi a polifluorohisztidinnel jelölt peptidek szelektív dúsítását a hagyományos polihisztidin címkék komplex keverékeinek jelenlétében a mosópufferek pH-jának megváltoztatásával.
