広告:
この記事では、タンパク質精製の四つの方法に光を投げます。
タンパク質精製の四つの方法は、(1)抽出(2)沈殿および微分可溶化(3)超遠心法および(4)クロマトグラフ法である。
タンパク質精製に使用される方法は、分析方法と分取方法に大別することができる。
:
この区別は正確ではありませんが、決定要因はタンパク質の量であり、その方法で実質的に精製することができます。 分析方法は、混合物中のタンパク質を検出して同定することを目的としていますが、調製方法は、構造生物学または産業用などの他の目的のために多 一般に、分取法は分析用途に使用することができるが、その逆は使用できない。
メソッド＃1。 抽出:
供給源によっては、タンパク質を含む組織または細胞を破壊することによってタンパク質を溶液中に持ち込む必要があります。 これを達成するにはいくつかの方法があります。凍結融解、超音波処理、高圧による均質化、または有機溶媒による透過性化を繰り返す。 選択の方法は、タンパク質がどのように脆弱であり、細胞がどのように頑丈であるかに依存する。
この抽出プロセスの後、可溶性タンパク質は溶媒中にあり、細胞膜、DNAなどから分離することができます。 遠心分離によって。 抽出プロセスはまた、溶液中のタンパク質の消化を開始するプロテアーゼを抽出する。 タンパク質がタンパク質分解に敏感である場合、通常、迅速に進行し、抽出物を冷却して、タンパク質分解を遅くすることが望ましい。
メソッド＃2。 沈殿および微分可溶化:
バルクタンパク質精製では、タンパク質を単離するための一般的な最初のステップは、硫酸アンモニウム(NH4)2SO4による沈殿 これはアンモニウムの硫酸塩の増加する量を加え、沈殿物蛋白質の異なった一部分を集めることによって行われます。 この方法の一つの利点は、それが非常に大量で安価に行うことができるということです。
:
精製される最初のタンパク質は水溶性タンパク質である。 一体膜タンパク質の精製は、同じ膜区画内にある他のものから任意の特定のタンパク質を単離するために、細胞膜の破壊を必要とする。 時には、ミトコンドリア膜に位置するタンパク質を精製する前に、細胞からミトコンドリアを単離するなど、特定の膜牽引を最初に単離することが
ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）のような洗剤は、精製中に細胞膜を溶解し、膜タンパク質を溶液中に保持するために使用することができるが、SDSは変性
メソッド＃3。 超遠心:
遠心分離は、液体中に懸濁された様々な質量または密度の粒子の混合物を分離するために遠心力を使用するプロセスです。 タンパク質や細菌細胞などの他の粒子状物質の混合物を含む容器（典型的にはチューブまたはボトル）を高速で回転させると、角運動量はその質量に比例した各粒子に外向きの力をもたらす。
この力のために与えられた粒子が液体を通って移動する傾向は、液体が粒子に及ぼす抵抗によって相殺される。 遠心分離機でサンプルを「回転させる」ことの正味の効果は、質量が小さく、緻密な粒子が、質量の少ない粒子または液体中のより多くの「抗力」を有する粒子
粒子の懸濁液を遠心分離機で”紡糸”すると、液体中の抗力が低い最も質量のある粒子が濃縮された容器の底に”ペレット”が形成されることがあります。 依然として大部分が液体中に残っている残りの非圧縮粒子は、「上清」と呼ばれ、上清をペレットから分離するために容器から除去することができる。
遠心分離の速度は、サンプルに加えられる角加速度によって指定され、通常はgと比較して測定されます。 このような「平衡」遠心分離は、所与の粒子の広範な精製を可能にすることができる。
スクロース勾配遠心分離:
砂糖（通常はショ糖グリセロール、またはパーコール）の直線的な濃度勾配は、最高濃度が底部にあり、最低濃度が上にあるようにチューブ内に生成されます。 タンパク質サンプルは、その後、勾配の上に層状化され、超遠心で高速で回転されます。 これにより重い高分子はより軽い材料より管の底の方に速く移動します。
スクロースが存在しない場合の遠心分離中、粒子が回転中心から遠くに移動するにつれて、より多くの遠心力を経験する（移動するほど速く移動する）。 これに関する問題は、容器内の有用な分離範囲が小さな観察可能な窓に制限されることである。
:
サンプルを2倍の長さで回転させても、関心のある粒子が2倍の距離に移動するという意味ではありません。 しかし、タンパク質がスクロース勾配を通って移動しているとき、それらは密度と粘度の増加の液体に遭遇する。
適切に設計されたスクロース勾配は、増加する遠心力を打ち消すため、粒子は遠心場にいた時間に近い比例して移動します。 これらの勾配によって分離された試料は、「速度帯状」遠心分離と呼ばれる。 タンパク質／粒子を分離した後、勾配を分画して回収する。
メソッド＃4。 クロマトグラフ法:
広告:
通常、タンパク質精製プロトコルには、一つ以上のクロマトグラフィステップが含まれています。 クロマトグラフィーの基本的な手順は、タンパク質を含む溶液を様々な材料を充填したカラムに流すことです。 異なるタンパク質は、カラム材料と異なって相互作用し、カラムを通過するのに必要な時間、またはカラムからタンパク質を溶出するのに必要な条 通常、タンパク質は、280nmでの吸光度によってカラムから外れているときに検出されます。
:
多くの異なるクロマトグラフィー方法が存在する：
1。 サイズ排除クロマトグラフィー:
クロマトグラフィーは、多孔質ゲルを使用して溶液または変性条件下でタンパク質を分離するために使用できます。 この手法は、サイズ排除クロマトグラフィーとして知られています。 原理は、より小さな分子が多孔質マトリックス中でより大きな体積を横断しなければならないことである。 結果的に、ある範囲のサイズのタンパク質は、ゲルのカラムの他端で収集される前に、可変体積の溶離剤（溶媒）を必要とする。
タンパク質精製の文脈では、溶離液は通常、異なる試験管にプールされる。 浄化するために蛋白質の測定可能な跡を含んでいないすべての試験管は放棄されます。 したがって、残りの溶液は、精製するためのタンパク質および他の同様の大きさのタンパク質からなる。
2. イオン交換クロマトグラフィー:
イオン交換クロマトグラフィーは、そのイオン電荷の性質および程度に応じて化合物を分離する。 使用されるカラムは、その種類と電荷の強さに応じて選択されます。 陰イオン交換樹脂は正電荷を持ち、負に帯電したcomポンドを保持して分離するために使用され、陽イオン交換樹脂は負電荷を持ち、正に帯電した分子を分離するために使用される。
:
分離が始まる前に緩衝は反対の荷電イオンを平衡させるためにコラムを通してポンプでくまれます。 サンプルの注入に、溶質の分子は緩衝イオンとそれぞれが樹脂の結合場所のために競うと同時に交換します。 各溶質の保持の長さは、その電荷の強さに依存する。
最も弱く帯電した化合物が最初に溶出し、続いてより強い電荷を持つ化合物が溶出します。 分離機構の性質のために、pH、緩衝剤の種類、緩衝剤の濃度、および温度はすべて分離を制御する上で重要な役割を果たす。 イオン交換クロマトグラフィーは蛋白質の浄化の使用のための非常に強力な用具で、分析的な、分取の分離で頻繁に使用されます。
3. アフィニティークロマトグラフィー:
アフィニティークロマトグラフィーは、多くの場合、アプリケーション固有の樹脂を利用する分子立体配座に基づく分離技術です。 これらの樹脂は、分離される化合物に特異的な配位子をそれらの表面に付着させている。 最も頻繁には、これらのリガンドは、抗体-抗原相互作用のそれと同様の様式で機能する。 リガンドとその標的化合物との間のこの「ロックおよびキー」適合は、それを非常に特異的にし、頻繁に単一のピークを生成し、試料中の他のすべては未保持
多くの膜タンパク質は糖タンパク質であり、レクチン親和性クロマトグラフィーで精製することができる。 洗剤可溶化タンパク質は、共有結合的に結合したレクチンを有するように修飾されたクロマトグラフィー樹脂に結合させることができる。
:
レクチンに結合しないタンパク質は洗い流され、特異的に結合した糖タンパク質は、レクチン結合部位で結合した糖タンパク質と競合する高濃度の糖を添加することによって溶出することができる。 レクチンの中には糖と競合しにくい糖タンパク質のオリゴ糖との親和性が高く、結合した糖タンパク質はレクチンを変性させることによって放出される必要があるものもある。
4. 金属結合:
一般的な技術は、タンパク質のC末端に6-8個のヒスチジンのシーケンスをエンジニアリングすることを含みます。 ポリヒスチジンはニッケルやコバルトなどの二価の金属イオンに強く結合する。 蛋白質はpolyhistidineの札を結合する固定化されたニッケルイオンを含んでいるコラムを通して渡すことができます。 タグのないタンパク質はすべてカラムを通過します。
タンパク質は、カラムへの結合のためにポリヒスチジンタグと競合するイミダゾール、または樹脂に対するタグの親和性を低下させるpHの低下（典型的には4.5）によって溶出することができる。 この手順は、一般的に設計された親和性タグ（6xhisタグまたはClontechのHATタグなど）を有する組換えタンパク質の精製に使用されるが、固有の親和性tor二価
5. 免疫親和性クロマトグラフィー:
イムノアフィニティクロマトグラフィーは、抗体の標的タンパク質への特異的結合を使用して、タンパク質を選択的に精製する。 この手順では、抗体をカラム材料に固定化し、それが選択的にタンパク質に結合し、他のすべてが流れる。 タンパク質は、pHまたは塩分を変化させることによって溶出することができる。 この方法はタグ内の工学を伴わないので、天然源からのタンパク質に使用することができる。
6. HPLC:
高速液体クロマトグラフィーまたは高圧液体クロマトグラフィーは、カラムを介して溶質をより速く駆動するために高圧を適用するクロマトグラフィーの一形態である。 これは、拡散が制限され、分解能が改善されることを意味する。 最も一般的な形態は、カラム材料が疎水性である「逆相」ＨＰＬＣである。
タンパク質は、アセトニトリルなどの有機溶媒の量を増加させる勾配によって溶出される。 蛋白質は疎水性に従って溶出します。 HPLCによる精製後、タンパク質は揮発性化合物のみを含む溶液中にあり、容易に凍結乾燥することができる。 HPLC精製は、精製されたタンパク質の変性をもたらすことが多く、したがって、自発的に再形成されないタンパク質には適用できない。
