ノイラミニダーゼは、ヒト気道上皮におけるインフルエンザウイルス感染の開始に重要である

ウイルス性ノイラミニダーゼ(NA)の主要な機能は、NAが細胞表面からシアル酸を切断し、感染細胞からのウイルス放出を促進する子孫ビリオンを開 細胞へのウイルス侵入中のNA機能については、あまり知られていない。 NAが粘液分解によって気道内の標的細胞へのウイルスアクセスを促進することが長い間想定されてきた（3）。 しかし、この概念は、適切な実験システムの欠如のために正式に証明されたことはありません。 さらに、感染の初期段階でのNAの役割に反対するいくつかの証拠が報告されている（参考文献2でレビュー）。

この問題に対処するために、ヒト気道上皮の培養物へのインフルエンザウイルスの侵入に対するNA阻害剤オセルタミビルカルボン酸（OC）（9）の効果を調 一次ヒト気管気管支上皮細胞（ＨＴＢＥ；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）および一次鼻上皮細胞（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ Ｇｍｂｈ）を、膜支持体（１ ２−ｍ ｍ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ−Ｃｌｅａｒ；Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．）無血清成長因子およびホルモン補充培地中の空気-液体界面で（6、8）。 完全に分化した４〜８週齢の培養物を全ての実験に使用した。 これらの培養物は、偽層化され、分極され、基底細胞、繊毛細胞、および粘液分泌細胞を含有し、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト気道上皮に密接に類似していた（図１ ０Ａ）。 1). 頂端側から２つの複製培養物に感染する直前に、ウイルス懸濁液および培養物の基底外側区画に、ＯＣ（１μ Ｍ、特に指示されない場合）を添加した。 二つの対照培養物は、阻害剤の非存在下で感染した。 一時間感染後、我々はウイルス接種物を除去し、細胞内ウイルス複製を可能にするために、追加の6時間の空気-液体界面で培養をインキュベートした。 その後、培養物を固定し、感染細胞をポリクローナル抗血清で全ウイルスに染色し、続いて対応するペルオキシダーゼ標識二次抗体（Dianova）およびアミノエチルカルバゾール基質（Sigma）を同定した。 陽性染色は細胞内のウイルス侵入に成功したことを示した。 培養物を、×３ ０ ０（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＭＴ−２）の倍率でｅｎ面で分析した。 ウイルス抗原を発現する細胞の総数は、培養物の直径に沿ってすべての連続した顕微鏡ビュー（0.28×0.42mm）を含む上皮セグメント（セグメント表面積、3mm2;セ 培養物を時計回りに45°回転させることによって、培養ごとに四つのセグメントをカウントした。＜７ ６ ５ ５＞＜４ ６ ７ ２＞ＨＴＢＥ培養物を用いた２回の実験では、ヒトウイルスＡ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１ ４／９ ６（Ｈ１Ｎ１）は、対照と比較してＮ ａ阻害剤の存在下で２ ２倍及び６ ５倍少ない細胞に感染 ２；表１）（Ｐ＜４ ５ １ ２＞０． ウイルスa/アヒル/アルバータ/119/98（H1N1）野生の水生鳥からとa/トルコ/イタリア/2379/99（H7n1）国内の家禽からもこれらの文化のOCに著しく敏感であった。 鼻上皮培養では、OCは、それぞれ120倍と520倍のヒトおよびアヒルウイルス感染を減少させた。 これらの結果から，ウイルスＮ Ａの阻害はウイルス感染の開始を抑制することが示唆された。

A/Chicken/Germany/R28/03(H7N7)は、2003年にオランダ、ベルギー、ドイツの商業養鶏場で家禽ペストの発生を引き起こした高病原性鳥インフルエンザウイルス系統に属する。 これらのウイルスは少なくとも89人のヒトに感染し、そのほとんどが結膜炎を呈したが、肺炎の致命的な症例も発生した（5）。 HTBE培養におけるH7N7鶏ウイルス感染は、それぞれ140と40倍1と0.1μ m OCの存在下で減少した。 これらの濃度は、75mgのリン酸オセルタミビルの投与後にヒトで達成される薬物の典型的な血漿最大および最小濃度を表し、予防のための推奨用量（9）。

我々の実験における感染阻害がウイルスNA酵素活性の阻害に直接関係しているという仮説を確認するために、我々はヒトA/Sydneyを使用した/5/97-ウイルス（H3N2）とNA9,000倍OCによる阻害にあまり敏感レンダリングNAのR292K置換とそのオセルタミビル耐性変異体のように（4）。 仮説と一致して、親ヒトウイルスはOCによって強く阻害されたが、両方のウイルスがHTBE培養物中の同じ実験で試験された場合、耐性変異体の阻害の最 今まで、適切な細胞培養アッセイは、ヒトにおけるシアル酸受容体と従来の実験室細胞株（9、11）の間のミスマッチのためにNA阻害剤に対するインフ ヒト気道上皮の分化培養はｎ ａ阻害剤に対するインフルエンザウイルス耐性の検出に適した細胞培養系であることを示唆した。

最後に、薬物感受性A/Sydneyを使用して/5/97-ウイルスと同様に，ウイルス接種後の異なる時間に添加されたOCによる感染抑制を試験した。 感染直前に薬物を添加したときに感染した細胞が47倍少ないのに対し、OCの添加による1時間の遅延は、未処理の対照に対してわずか1.5倍の阻害を ウイルス接種の4時間後に薬物を添加した場合、統計的に有意な阻害は観察されなかった。 これらのデータは，ＯＣがウイルス複製に先行する感染の初期段階に影響を及ぼすことを示唆した。

要約すると、ヒト気道の繊毛上皮のウイルス侵入の段階でのNAの本質的な役割について、ここで初めて直接的な実験的証拠を提供しました。 この段階でのNA機能は、ムチン、繊毛、および細胞性グリコカリックス上のデコイ受容体の除去であり、それぞれに強い結合が標的細胞の表面膜上の機能的受容体へのウイルスアクセスを妨げる可能性が最も高い。 しかし、他のNA機能—例えば、ヘマグルチニンを介した融合（7）の促進-を排除することはできず、NAが気道上皮細胞へのウイルス侵入を促進する正確な機

高病原性H7N7およびH5N1鳥インフルエンザウイルスに対するワクチンはまだ利用可能ではないが、抗ウイルス薬は鳥インフルエンザと戦う唯一の選択肢である(10)。 他の抗インフルエンザ剤と比較して、Ｎ Ａ阻害剤は、十分に耐容され、インフルエンザＡおよびｂウイルスのすべての株に対して有効である。 そこにウイルス抵抗性の出現のほとんど証拠があった、と変異ウイルスの感染性は、通常（妥協されている9、11）。 細胞内へのウイルス侵入の前に感染を抑制するNA阻害剤の能力は、予防措置のための高い可能性を強調しています。 特に、我々のデータは、鳥インフルエンザウイルス感染のリスクが高い人のためのこれらの化合物の予防的使用をサポートするための科学的根拠を提