簡単な紹介：ブロッティング技術
ブロッティングは、タンパク質および核酸の同定のために分子生物学で使用され、診断目的に広く使用されている。 この技術は、ニトロセルロース膜またはナイロンである支持体上に関心のある分子を固定化する。 それは特定の核酸および遺伝子の同一証明のためにハイブリダイゼーションの技術を使用する。
ブロッティング技術は、遺伝子発現の異なる段階でad DNA、mRNA、タンパク質などの生体分子を同定するために使用されるツールです。 蛋白質の統合はそれぞれの蛋白質を作り出すためにmRNAに変換されて得るDNAの区分の表現を含みます。
北部、西部の&南部などのブロッティングのサブタイプは、求められている標的分子に依存します。 ＤＮＡ配列がタンパク質分子の基礎またはコードである場合、関心のある特定のＤＮＡ分子は、サザンブロット法を使用してブロットすることができる。 遺伝子発現の間、ＤＮＡがタンパク質産生のためのｍＲＮＡとして発現される場合、このプロセスはノーザンブロッティングによって同定することができる。 最後に、コードされたmRNAは関係する蛋白質を、この蛋白質の同一証明ウェスタンブロッティングによってすることができます作り出します。
ブロッティングの一般的な手順
- サンプルを均質化します。
- 電気泳動膜による目的分子の分離。
- 分子のハイブリダイゼーションまたは同定
ノーザンブロッティング
ノーザンブロッティングは、遺伝子発現の研究に使用される技術です。 これは、特定のＲＮＡ（または単離されたｍＲＮＡ）の検出によって行われる。 ｍＲＮＡは、一般に、全体のＲＮＡ配列の５％として表される。 この方法は、特定の遺伝子の同一性、数、活性、およびサイズを明らかにする。 このブロッティング技術はまた、組織または生物の成長のために使用することができる。 分化および形態形成の異なる段階では、ＲＮＡの存在量が変化し、これはこの技術を用いて同定することができる。 それはまた分子レベルで異常な、病気にかかったか、または感染させた状態の同一証明を援助します。 ノーザンブロット法は、1977年にスタンフォード大学のJames Alwine、David Kemp、George Stankによって開発されました。 この技術は、サザンブロッティングとのプロセスの類似性のためにその名前を得た。 これら二つの技術の主な違いは、ノーザンブロッティングはRNAのみに関係するということです。
原理
すべての通常のブロッティング技術として、ノーザンブロッティングは、サイズ別にRNAサンプルを分離するための電気泳動から始まります。 電気泳動は、核酸の電荷に基づいてRNA分子を分離する。 核酸中の電荷は、核酸配列のサイズに比例する。 このように電気泳動膜は、ＲＮＡ配列の大きさに応じて核酸配列を分離する。 我々の標的配列がｍＲＮＡである場合、ｍＲＮＡはポリ（Ａ）−尾部によって特徴付けられるので、試料はオリゴセルロースクロマトグラフィー技術によって単離することが ゲル分子は本質的に脆弱であるため、分離された配列はナイロン膜に移される。 ナイロン膜の選択は、核酸が本質的に負に帯電している要因に寄与する。 一旦ＲＮＡ分子が移動されると、それは共有結合によって固定化される。 プローブはその後添加され、プローブはss DNA配列を相補的にすることができる。 ホルムアミドは、アニーリング温度を低下させるため、ブロッティング緩衝液として一般に使用される。
手順
- 収集した組織または培養サンプルを最初に均質化します。 サンプルは比較のための異なったタイプの文化の代表であるか、または文化の中の成長の異なった段階の調査のためである場合もあります。
- RNA配列を電気泳動単位で分離し、核酸分離の目的でアガロースゲルを使用する。
- ここで、分離したRNA配列がナイロン膜に移されます。 これは、毛細管作用とイオン相互作用の二つのメカニズムによって行われます。
- ゲルを以下の順序で保持することにより、転写操作を行う。 最初に、アガロースゲルをスタックの底部に置き、続いてブロッティング膜を置く。 これらのペーパータオルの上に穏やかな重量（ガラス板）が置かれる。 全体の組み立ては移動の緩衝を含んでいるビーカーで保たれる。
- ナイロン膜に転写されたRNAは、UV放射を用いて固定される。
- 固定ナイロン膜をプローブと混合します。 プローブは、関心のある遺伝子のために特別に設計されているので、関心のある配列に対応するブロット上のRNA配列とハイブリダイズする。
- ブロット膜を洗浄して不要なプローブを除去する
- 標識されたプローブは化学発光またはオートラジオグラフィーによって検出される。 結果はx光線のフィルムの暗いバンドです。
ゲルとプローブ
RNAサンプルは、ホルムアルデヒドを変性剤として用いたアガロースゲルを用いて分離されるが、小さなRNAまたはマイクロRNA配列では、尿素を変性剤として用いたポリアクリルアミド配列も使用することができる。 臭化エチジウムは染色剤として使用することができる。 マーカーの2つのタイプはサイズの印のためです。 RNAラダーとリボソームサブユニットは、RNA配列のサイズの同定のために使用されます。
プローブは、目的のRNAの全体または一部に相補的であり得る。 それらは、標的ＲＮＡに相補的な塩基対２ ５個のＲＮＡ、ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドであり得る。 RNAの調査の場合には、invivoの調査が厳密な洗浄が原因で変化できるのでinvitroによって作り出される調査は使用される。 CDNAの場合には、調査は化学ルミネセンスの場合には放射性同位体、アルカリホスファターゼまたは西洋わさびのperoxidaseと分類されます。
