ポリヒスチジン-タグ

タンパク質精製編集

ポリヒスチジン-タグは、大腸菌および他の原核生物の発現系で発現されるポリヒスチジンタグ組換えタンパク質の親和性精製によく使用される。 細菌細胞は、遠心分離によって回収され、得られた細胞ペレットは、物理的手段によって、またはリゾチームのような洗剤および酵素またはこれらの任 この段階では、生のライセートは、細菌宿主に由来する他の多くのタンパク質の中で組換えタンパク質を含む。 この混合物は、異なる品種で市販されている結合した二価のニッケルまたはコバルトイオンを含む親和性樹脂とインキュベートされる。 ニッケルとコバルトは同様の性質を持ち、隣接する4つの遷移金属（v.iron triad）である。 これらの樹脂は、一般的に、ポリヒスチジン-タグがマイクロモル親和性で結合するニッケルのためのイミノジ酢酸（Ni-IDA）およびニトリロ三酢酸（Ni-NTA）およびコバルトのためのカルボキシル-メチルアスパラギン酸（Co-CMA）のようなキレート剤で官能化されたセファロース/アガロースである。 Erst Hochuli et al. nta配位子とニッケルイオンをアガロースビーズに結合させた。 次に、樹脂をリン酸緩衝液で洗浄して、コバルトまたはニッケルイオンと特異的に相互作用しないタンパク質を除去する。 Niベースの方法では、20mMのイミダゾール（タンパク質は通常150-300mMのイミダゾールで溶出される）の添加によって洗浄効率を改善することができる。 一般的に、ニッケル系樹脂は結合能力が高く、コバルト系樹脂は最高の純度を提供します。 タンパク質の純度および量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングによって評価することができる。

ポリヒスチジンタグを用いた親和性精製は、通常、組換えタンパク質が原核生物で発現されると、比較的純粋なタンパク質になる。 タンパク質相互作用を研究するためのタンパク質複合体の精製を含む下流の用途に応じて、酵母や他の真核生物などの高等生物からの精製は、より高純度を得るために二つのタグを用いたタンデム親和性精製を必要とする場合がある。 あるいは、ニッケルイオンではなく固定化されたコバルトイオンを用いたシングルステップ精製は、一般的に純度の大幅な増加をもたらし、hisタグタ

ポリヒスチジンタギングは、その作用様式がタンパク質の一次構造にのみ依存するため、変性条件下で組換えタンパク質を精製するための選択 例えば、組換えタンパク質をｅで強制的に発現させた場合であってもよい。 大腸菌は封入体を産生し、可溶性タンパク質として得ることができず、尿素または塩酸グアニジンによる変性で精製することができる。 一般的に、この種の技術では、ヒスチジン結合は、イミダゾール結合の代わりにpHを用いて滴定され、高pHでは、ヒスチジンはニッケルまたはコバルトに結合するが、低pH（コバルトでは6、ニッケルでは4）では、ヒスチジンはプロトン化され、金属イオンから競合する。 これを抗体精製およびGST精製と比較すると、その前提条件は、関与するタンパク質の適切な（天然の）折り畳みである。 一方、Hisタグは、他の親和性タグよりも凝集して不溶化する傾向があると言われています。

ポリヒスチジンタグカラムは、不純物としていくつかのよく知られたタンパク質を保持します。 そのうちの一つは、25kda（SlyD）の周りに現れるFKBP型ペプチジルプロリルイソメラーゼである。 不純物は、一般に、二次クロマトグラフィー技術を使用して、またはSlyD欠損大腸菌株中の組換えタンパク質を発現させることによって除去される。 あるいは、ニッケル系と比較すると、コバルト系樹脂は大腸菌由来のSlyDとの親和性が低いが、いくつかのケースでは適度に有用である。

二つのポリヒスチジンタグから一つを分離するedit

ポリヒスチジンタグの数が異なるタンパク質は、ニッケル親和性樹脂とは異なる溶出する。 単一のヘキサヒスチジンタグを有するタンパク質では、75mMのイミダゾールはNi-NTAからの溶出を可能にするが、二つのヘキサヒスチジンタグを有するタンパク質では、100mMのイミダゾールが溶出に必要である。 特定の実施形態では、本発明は、ｐｒｏ２ ２ ４、ＰＲＯ９ ７ ８ ３、ＰＲＯ１ １ ０ ８、ＰＲＯ３ ４ ０ ０ ０、ＰＲＯ２ ４ ０、ＰＲＯ９ ４ ３、ｈｕＡ３ ３、ＰＲＯ２ ３ ０、ＰＲＯ１ ７ ８、ＰＲＯ１ １ ９ ９、ＰＲＯ４ ３ ３ ３、ＰＲＯ１ ３ ３ ６、ＰＲＯ１ ９ ５ ９ ８、ＰＲＯ１ ０ ８ ３、ｈｕＴＲＰＭ２又はＰＲＯ１ ８ ０ １産物は薬学的に許容される塩である。 このようなアプローチは、一価ストレプトアビジンの単離に使用された。

Binding assaysEdit

ポリヒスチジンタギングは、プルダウンアッセイと同じ方法でタンパク質-タンパク質相互作用を検出するために使用することができます。 しかし、この技術は一般的にはあまり敏感ではないと考えられており、また、この技術のより厄介な側面のいくつかによって制限されている。 例えば、還元条件は使用できず、ＥＤＴＡおよび多くの種類の洗剤は使用できない。 二重偏光干渉法の最近の進歩は、EDTAと試薬の広い使用に従順であり、そのようなサイト固有のタグの使用が大幅に関連する立体配座変化の直接測定

ヘキサヒスタジンCyDyeタグも開発されている。 これらはポリヒスチジンの札に付す染料を作成するためにfluorophoresに付すEDTAのグループにニッケルの共有配位を使用します。 この技術は、タンパク質の移動と人身売買に続くために有効であることが示されています。 また、この技術が蛍光共鳴エネルギー移動を介して距離を測定するために有効であることを示す最近の発見があった。

フルオロヒスチジンタグ編集

ポリフルオロヒスチジンタグは、in vitro翻訳系での使用のために報告されています。 このシステムでは、ヒスチジンが4-フルオロヒスチジンに置き換えられる拡張された遺伝コードが使用される。 フッ素化アナログは、ヒスチジン-tRNAリガーゼの緩和された基質特異性を介してペプチドに組み込まれ、タグの全体的なpKaを低下させる。 これは従来のpolyhistidineの札の複雑な混合物の前で洗浄緩衝のpHの変更によってpolyfluorohistidineによって付けられるペプチッドの選択的な強化を可能にする。