マイセトーマに罹患した骨組織における従来の脱灰とマイクロ波支援法との比較

要約

マイセトーマは、皮下組織および骨の生涯にわたる肉芽腫性疾患である。 病理組織学は、マイセトーマの確定診断の前提に基づく実証された指標的方法である。 それは骨の脱灰を含むティッシュの有効な処理を要求する。 脱灰プロセスはカルシウムの完全な取り外しおよびティッシュおよび微生物の汚損の能力のまた適切な保存を保障しなければなりません。 目標。 異なる脱灰溶液を用いたマイクロ波法と脱灰に使用される従来の方法を比較する。 マイセトーマに罹患した骨組織における脱灰および形態学的および真菌保存の速度を含む異なる特性を試験した。 材料および方法。 三つの脱灰溶液は、10％中性緩衝EDTA（pH7.4）、5％硝酸、および5％塩酸を含むマイセトーマに影響を受けた50骨組織サンプルからカルシウムを除去するために採用 従来の方法とマイクロ波法を用いた。 ヘマトキシリン-エオシン（Ｈ ｅ）染色，Ｇｒｉｄｌｅｙ染色，Ｇｒｏｃｏｔｔヘキサミン-銀染色を用いて骨および真菌の形態を評価した。 結果。 従来の方法の脱灰時間は、10％EDTA（pH7.4）を用いたマイクロ波法と比較して120時間と29時間を要し、5％塩酸と5％硝酸は別々に8時間と3時間を要した。 また、10%EDTAは彼の汚損および菌類の汚れのための最もよい脱灰の代理店です。 5％塩酸および5％硝酸を真菌染色に使用することができる。 結論。 本研究では，異なる脱灰剤と二つの脱灰手順が骨構造の保存と真菌染色に及ぼす影響を調べた。

1. はじめに

マイセトーマは、皮膚および皮下組織の生涯にわたる肉芽腫性、徐々に有害な流行病であり、筋肉や骨のようなより深い構造に進行し、主に足の広範な破壊につながり、広範な局所外科的切除または四肢切断を必要とする。 Mycetomaは炎症性滲出液の拡張、排出の湾曲および植民地穀物の存在のtriumvirateによって定義されます。 感染症は、真菌感染症または放線菌感染症（細菌感染症）に分類されます。 それは広く熱帯および半熱帯地域の状態であり、顕著にスーダンである。 マドゥレラmycetomatis作物の穀物は、0.5から3ミリメートルに至るまで、巨大であり、丸みを帯びた楕円形、または三葉に表示されます。 それらは、間質茶色がかったセメントに染み込んだ十字状の菌糸からなり、メラニン様の黒褐色の色素からなる。 病理組織学はmycetomaの病気の確定診断の仮定の有利なプロセスと同様、速い表した方法で、原因物質の形態学的な提示を記述するレポートを含んでいます。 原因物質は依然として関与する骨組織から単離することができる。 脱灰は、骨の病理組織学的検査のために一般的に達成される基本的なステップである。 骨中のミネラルはカルシウムとリンで構成され、不溶性塩は骨組織の六十パーセント以上を占めています。 これらの鉱物は骨の硬度を提供し、回転式ミクロトームを使用してティッシュの切断の間に難しさの原因です。 このような組織は、組織をミクロトームによって切断されるのに十分に繊細にすることによって、脱灰として知られる手順によってリン酸カルシウムを抽出するために処理されなければならない。 脱灰は、可溶性カルシウム塩またはカルシウムイオンに結合するキレート剤を形成する酸によって達成される。 現在の従来の脱灰方法は、骨の折れるプロセスと組織の染色反応の持続的な失敗によって特徴付けられる。 脱灰の従来の方法では、骨組織は室温で脱灰液中に置かれ、終点に達するまで一定の間隔で溶液が変化する。 マイクロ波脱灰は従来の方法と比較して革新的な技術である。 このプロセスでは、固体ティッシュは終了点が達成されるまで脱灰の液体の通常の転位の周期的な持続期間のための電子レンジの脱灰の解決に置か マイクロ波放射は、約数日から数時間に脱灰の手順を加速するために行われています。 本研究の目的は，脱灰に用いられる従来の方法と，異なる脱灰溶液を用いた修正マイクロ波法とを比較することであった。 Ｍａｄｕｒｅｌｌａｍｙｃｅｔｏｍａｔｉｓ感染で影響を受けた骨組織における脱灰および形態学的および真菌保存の速度を含む異なる特性を試験した。

2. 材料と方法

これは、マデレラmycetomatis原因生物の完全な同定のためのhaematoxylinとeosin、Gridley、およびGrocott hexamine-silver染色を用いて、マイセトーマ感染によって影響を受ける組織形態に関して、従来の脱灰手順とマイクロ波強化脱灰手順を比較することを目的とした実験的記述的研究である。 この研究は、そば大学病院のマイセトーマ研究センターとアルネライン大学医学部で行われました。 全患者から書面によるインフォームドコンセントを得た。 マイセトーマに罹患した五十の切断された四肢を採取した。 骨生検は、適切な鋸を用いて厚さ5mmの小片に切断し、次いで10％正式な生理食塩水に48時間固定した。 それらを流水で３ ０分間洗浄して固定剤を除去した。

2.1. 従来の脱灰手順

厚さ5mmの骨生検切片を、室温（平均28℃）に置いた5％塩酸水溶液（HCl）、5％硝酸水溶液（HNO3）、および10％エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）を100ml含む250mlのPyrex Squatビーカーに浸した（表1参照）。 脱灰の終点は、次のように二時間間隔の後に二つの酸脱灰剤（5％HNO3および5％HCl）のシュウ酸カルシウム法を用いてチェックした: 使用した脱灰液5mlを試験管に入れ、リトマス紙を加え、リトマス紙が変化するまで水酸化アンモニアを滴下し、アルカリpH脱灰液が透明であったことを示した。 脱灰溶液が濁ったときに5mlの飽和シュウ酸アンモニウム溶液を加え、骨組織内にカルシウムが存在することを示し、脱灰溶液を新しい溶液に置き換え、脱灰プロセスが完了するまで30分ごとにプロセスを繰り返した。 ＥＤＴＡでは，骨が針で容易に貫通したときに脱灰プロセスが終了したと考えられる脱灰物理試験を用いた。 平均全脱灰時間は、それぞれ5％硝酸、5％HCl、および10％EDTAについて7時間および30分、8時間および120時間であった。

2.2. 電子レンジの手順

不動の回転板を備えた家庭用電子レンジ（Midea Microwave20L、700W、Digital、EM720CFF）を使用しました。 100mlの蒸留水を含むガラスビーカーを5秒間予熱してマグネトロンを加熱した。 これを100mlの新鮮な蒸留水に置き換え、照射して温度を約41〜43℃に維持した。 使用した電子レンジは一定のタイミングを持っていたが一定の温度ではなかったので，ガラスビーカーはオーブン内の様々な点に割り当てられ，マイクロ波脱灰中に試料の最良の位置を解決するために照射した。 骨生検の5mm厚切片の三枚を、250mlのPyrexスクワットビーカーに浸漬し、100mlの5％塩酸水溶液（HCl）、5％硝酸水溶液（HNO3）、および10％EDTAを含有した。 その後、それらを電子レンジに移し、酸脱灰剤（5％HNO3および5％HCl）のために2〜4時間の合計時間のために、各10秒の10サイクル（15分間隔で）照射した。 脱灰液の温度は41-43℃前後に維持され、脱灰液と脱灰の終点をチェックし、脱灰液を脱灰完了まで繰り返し変更した。 脱灰の終点は前述のようにシュウ酸カルシウムおよび物理的なテストを使用して点検されました。 平均全脱灰時間は、それぞれ、５％硝酸、５％HCl、および１ ０％EDTAについて、３時間および４ ５分、５時間および３ ０分、および２ ９時間および４分であった。 完全な脱灰後、組織を蒸留水を使用して洗浄し、使用した酸を中和するために0.3％アンモニア溶液に5分間移した。

2.3. 組織処理および染色

標本に以下のプロトコルを用いて自動組織処理を施した：骨生検を10％正式な生理食塩水に1時間入れた。 その後、50％アルコール一時間、70％アルコール一時間、90％アルコール一時間、続いて100％アルコール三変化それぞれ二時間、キシレン二変化、それぞれ一時間半、最後にパラフィンワックス二変化それぞれ二時間。 組織はパラフィンブロックに埋め込まれ、回転ミクロトームを用いて5-6μ mの厚さに切断された。 切片は、1903年にメイヤーによって記載されたように、メイヤーのヘマトキシリンで染色され、それぞれの対染色は1％エオシン（HE）であった。 グリドリーの染色は、1953年にグリドリーによって記載されたように真菌の実証に使用された）; 脱脂および再水和の後、組織切片を２％クロム酸中に３ ０分間入れた。 次いで、それらを水道水でよく洗浄し、蒸留水ですすいだ後、Ｓｃｈｉｆｆ試薬中に２ ０分間入れた。 次いで、それらを流水で１ ０分間洗浄し、７ ０％エタノールですすぎ、次いで９ ５％エタノールですすいだ。 彼らはメタニルイエローで一分間counterstainedし、蒸留水でよくすすぎました。 その後、それらをキシレン中で脱水し、ジスチレン、可塑剤、およびキシレン（DPX）に取り付けた。 その後、切片を顕微鏡下で調べた。 また、1955年にGrocottによって記載されたGrocottヘキサミン-銀法は、4％クロム酸水溶液で一時間酸化し、水で数秒間洗浄し、1％メタ硫酸ナトリウムで一分間処理し、流水で3分間洗浄し、蒸留水で十分にすすぎ、60℃の水浴中で予熱された作業銀溶液に入れて20分間、蒸留水でよくすすぎ、流水で5分間洗浄し、作業薄緑色で15分間counterstainedした。秒、脱水され、キシレンで取り除かれ、取付けられて ＤＰＸを、最終的に顕微鏡下で調べた。

2.4. 結果の評価

切片は、専門家の病理組織学者によって評価された。 脱灰手順の品質と染色結果も評価され、経験則によって評価され、脱灰の品質は、脱灰の時間、組織形態の形態学的保存、およびHeによるMadurella mycetomatis真菌によって評価され、GridleyおよびGrocott methenamine-silver染色は1から4（1：不良、2：公正、3：良好、および4：優れていた）に格付けされた。

2.5. 統計分析

データ分析はSPSSプログラムを用いて行った。 片方向Ａ ＮＯＶＡを使用して、切片品質および真菌保存の定量的分析に対する３つの脱灰溶液の効果を証明した。 Ｋｒｕｓｋａｌ-Ｗａｌｌｉｓ検定を行って，二つの実験と共に評価した各パラメータについて試験した解の間に有意な差があるかどうかを決定した。 との差は統計的に有意であると解釈された。

3. 結果

黒い穀物を持つMadurella mycetomatisの五十例が研究に含まれていました。 足は48例（96％）と手の二つのケース（4.0％）で最も影響を受けた解剖学的領域であった。 異なる実験における脱灰時間については、10%EDTA(pH7.4)による脱灰には従来の方法で最も長い時間がかかり（マイクロ波では120時間に対して29時間まで）、酸脱灰溶液の使用には8時間から3時間の最短時間がかかった。 脱灰マイクロ波法を用いた異なるタイプの脱灰溶液の組織形態の質は，核および細胞質の外観に関してＭａｙｅｒのヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いた従来の方法と比較して可変の結果を達成した。 また、10％EDTA脱灰骨は、5％HNO3および5％HClと比較して有意に優れた結果（カイ二乗試験を用いたP値：0.023）を有するように見えた。 優秀な汚損のレポートは対43（86%）でした32 (64%), 42 (84%) 18人（36％）、33人（66％）、1人（2％）であった。 グロッコットメテナミン銀染色法は、真菌の形態と明るさに関するマドゥレラmycetomatis原因物質のデモンストレーションのために使用され、10％EDTA、5％HNO3、および5％HCl32 (64%), 33 (66%) 39人（78％）、22人（44％）、31人（62％）とそれぞれ比較した。 Madurella mycetomatisに使用される他の真菌染色は、真菌の形態に関するGridley染色であり、10％EDTA、5％HNO3、および5％HClで脱灰した骨の染色品質は、従来のマイクロ波法を使用して有意に優れた所見（カイ二乗検定を使用したP値：0.003）を示した。43（86％）対41 (82%), 32 (64%) 34人（68％）、23人（46％）、35人（70％）とそれぞれ比較した。 これらの結果を表２にまとめる。 図1は、異なる脱灰剤および条件を用いた染色結果を示している。

図1

異なる脱石灰剤および条件を用いた染色結果の実証。

4. Discussion

Madurella mycetomatisの原因物質の病理組織学的同定は、金本位制の手順であるため十分に確立されていますが、硬組織および骨は、組織構造および原因物質の形態を保 原因物質はhaematoxylinおよびeosin(HE)および菌類の特別な汚れを使用して識別することができます従って骨はティッシュ、原因物質の形態および汚れの能力を保 骨の脱灰は退屈な技術です。 それは週を要求し、ティッシュ構成の保存は脱灰のプロシージャの卓越性そして速度によって決まります。 脱灰プロセスを迅速化するために電子レンジを用いた新しいプロセスを実現した。 脱灰剤の選択と方法は基本的に方法の熱心さによって決定され、組織学的技術におけるマイクロ波エネルギーの可能な使用は1970年にメイヤーズによって最初に文書化された。 この非イオン化放出法のシステムは，脱灰プロセスの高速化と考えられた。 分子動力学はそれから放射が停止するまで持続するエネルギー変更の生産を引き起こします。 本研究では、マイクロ波強化脱灰のために報告された脱灰時間と従来の脱灰手順は、それぞれ29と120時間10％EDTA（pH7.4）、5％硝酸と三時間と七時間、5％HClと五と八時間 マイセトーマ感染の影響を受けた骨組織に対するマイクロ波脱灰法は，従来の方法よりも有意に高速であることが明らかであった。 また、5％の硝酸は、5％の塩酸、その後EDTA（pH7.4）の両方の方法のために続いて、より速い脱石灰能力を持っていた。 Pitol et al. ラット骨のカルシウムを8.5％EDTA溶液で除去するために家庭用電子レンジ調理器を使用し、従来のプロセスでは45日からマイクロ波支援プロセスでは48時間に試用期間の減少を示した。 この研究では、10％EDTA溶液は、従来の方法で120時間、マイクロ波を使用して29時間かかり、マイセトーマ感染で影響を受けた骨組織の完全な脱灰を達成した。 実験におけるＥＤＴＡの濃度はＰｉｔｏｌらより多かった。’sの勉強。 骨の大きさ、厚さ、およびタイプの違いに加えて、これらは、Pitol et al.の脱灰の時間の増加についての可能な説明であり得る。私たちの設定で削減された研究。 さらに、5％硝酸を用いた従来の方法でマイセトーマ感染の影響を受けた骨の脱灰は七時間を要したのに対し、電子レンジ法は三時間を要した。 同等の成果は、BalatonとLogetによって達成されました。 さらに、本研究では、他の研究から脱灰時間が短縮された。 従来およびマイクロ波法で報告された脱灰時間は、一日から四時間から5日の範囲であり、酸脱灰溶液と10％EDTA（pH7.4）でそれぞれ2日から7日の間の時間を報告しているげっ歯類の骨の他の研究と比較して低いと考えられている。 柴田らのグループは、10％HCl、10％硝酸、および10％EDTAを用いて、1日から7日まで変化するほぼ同様の脱灰時間を報告した。 しかし、彼らはより高い濃度の酸脱灰剤を使用した。 Umaら。 ラット骨におけるマイクロ波脱灰を用いて四つの異なる脱灰流体の効果を評価し、1-1.5日の5％硝酸および7％HCl/2％EDTAを報告した。 しかし、10％のEDTAは、骨の種類に応じて14-26日を要した。 これらの研究では、骨の種類、性質、および大きさは、ここで分析されたものとは異なり、異なっていた。 脱石灰化法は組織切片の優位性と染色の精度の重要な理由であった。 Philipp et al. (2019)は、脱灰法は、タンパク質構造を変化させ、組織の染色能力に影響を与える有意な形態学的変化を引き起こすことを記載した。 我々の研究では、骨はルーチン手動法で5％硝酸で処理され、マイクロ波支援脱灰と比較して軟部組織の腫脹および核および真菌染色の損失があった。 酸脱石灰剤は、通常、骨および軟部組織の恒常性を乱す。 5％硝酸におけるこれらの特殊効果は、取られた期間および溶液の酸性度のためである。 従って、より速い脱灰によりH&Eおよび菌類の特別な汚れでより大きい傷害そしてより大きい効果を引き起こします。 いくつかの真菌は、Grocottのmethenamine-silver（GMS）染色および/またはGridley（GS）染色のような組織化学的染色を使用して組織学的切片で実証することができる。 いくつかの真菌は、形態学的構造に基づいて組織内で正確に実証することができるが、認識有効性は、従来の方法を用いて長期固定および脱灰後に減 本研究では、マイクロ波支援脱灰は、h&Eと10％EDTAが最高の脱灰のための長い時間を取るにもかかわらず、組織構造と真菌染色能力を保存した溶液であった真菌の特殊染色を使用して形態のための従来の方法と比較して優れた染色を与えた。

5. 結論と勧告

電子レンジの使用によって強化された脱灰は、脱灰のための新しい技術です。 この技術は、脱灰液として10％EDTA、5％硝酸、および5％塩酸を使用してマドゥレラmycetomatis感染に影響を受けた骨組織で調べた。 これを室温での従来の脱灰と比較して，骨構造のためのＭａｙｅｒのヘマトキシリンおよびエオシン染色および真菌形態のためのＧｒｏｃｏｔｔおよびＧｒｉｄｌｅｙ染色を用いて脱灰および組織形態の速度を決定した。 室温での真菌の明るさが低下した細胞形態および真菌胞子および菌糸の両方において、従来の方法と比較してより良い結果が得られた。 この知見は，マイセトーマ感染の影響を受けた骨組織の分析に適したプロトコルの開発に役立つ可能性がある。

6. 本研究の限界

サンプルサイズが大きいほど、より決定的な結果が得られたでしょう。 また、脱灰時間は硬組織の大きさや構造密度に依存するため、手以外の骨重量や骨サンプルを使用すると、脱灰にかかる時間が異なる可能性があります。 最後に、私たちは家庭用電子レンジを使用しているので、私たちの温度記録はおおよそのものかもしれません。

データの可用性

現在の研究中に生成されたデータセットは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手可能です。

倫理的承認

この研究は、Al Neelain大学医学部のInstitutional Review Boardによって承認されました。

利益相反

著者は利益相反はないと宣言しています。

謝辞

著者は、スーダンのハルツーム大学マイセトーマ研究センターのスタッフに心から感謝の意を表し、病理学名誉教授のAhmed Hassan Fahal教授とAhmed Mohammed El Hassan教授に特別な感謝の意を表したいと考えています。

補足資料

この研究の知見を支持するために使用された材料および試薬は、補足情報の中に含まれています。 （補足資料）