凍結保存-概要|ScienceDirect Topics

10.4.2哺乳類細胞の凍結保存のためのトレハロース

凍結保存は、非常に低い温度で長期間にわたって細胞を保存するために一般的に採用されている。しかし、凍結および解凍中に起こる物理的変化は、細胞の生存および機能に有害であり得る。したがって、凍結保護剤は、凍結保存中に細胞に添加されなければならない。細胞の凍結保護剤としてのトレハロースの使用は、細胞がより長い期間保存されるためには、細胞膜の両側にポリヒドロキシ化合物が必要であるという Trehaloseはさまざまな人間の細胞のcryopreservationのためのprotectantとして複数のグループによって探検されました。

thermotropic液相転移を用いて膵ランゲルハンス細胞にDMSOとともにトレハロースを導入した。トレハロースによる凍結保存は、DMSO単独で使用した唯一の58％の回復と比較して、大人の島の92％の回復をもたらした。トレハロースで凍結保存された島からの移植片には，トレハロースを含まないものよりも十四倍以上のインスリンが見られた。 Trehaloseとcryopreserved人間の胎児の島そっくりの細胞の集り(ICCs)の回復はtrehaloseなしでそれらのための42%だけと比較される94%だった。ヌードマウスに移植すると、トレハロースで凍結保存されたICCからの移植片のインスリン含有量の15倍の増加が観察された。これらの結果は，凍結保存剤としてのトレハロースの添加がヒトすい内分泌組織の非常に高い生存率をもたらすことを示している。

トナーと共同研究者は、孔形成タンパク質α-溶血素の遺伝子操作バージョンを用いて哺乳動物細胞に低濃度のトレハロースを導入し、細胞内トレハロースが凍結保存中のこれらの細胞の生存を大幅に改善できることを見出した。凍結保存されたマウス線維芽細胞およびヒトケラチノサイトの長期解凍後生存率は、それぞれ80％および70％であり、細胞内トレハロース濃度は0.2Mであった。細胞内トレハロースはまた、乾燥した哺乳動物細胞の膜の完全性に有益な効果を有することが判明し、数週間の穏やかな条件下で細胞を乾燥して保存

ヒト肝細胞の凍結保存に対するトレハロースの効果をKatenz et al. . 10％DMSOと0.2Mトレハロースと培地中で凍結した肝細胞は、DMSO単独と比較して解凍後の細胞生存率とめっき効率の有意な改善を示した。凍結保存中のトレハロースの存在はまた、添付細胞の総タンパク質レベルの増加、より高いアルブミン分泌レベルと解凍後の低いアスパラギン酸アミノ

幹細胞は、造血の調査、新しい治療戦略の開発、特定の疾患のモデルシステムのための重要なツールです。凍結保存の発展にもかかわらず、解凍後の細胞死は依然として大きな問題である。マルティネッティ他凍結保存の正常なコースの間に起こる細胞の損失を防ぐために末梢血からの純粋なhematopoietic幹そして前駆細胞をcryopreserveするのに使用されたtrehalose。表面幹マーカー CD34の発現を評価し、1Mトレハロースは、DMSOを使用して標準的な凍結法と比較した場合、より高い細胞数と細胞生存率とCD34+細胞に改善された凍結保護を提供することが判明した。また、より短く、より長い期間のためのトレハロースと凍結保存は、解凍後に巨核球細胞に分化するCD34+細胞の能力を保持した。これらの結果は、凍結保護剤として使用された場合、幹細胞の生存率および機能を保持するトレハロースの能力を示唆している。

高生存度を維持しながら赤血球（Rbc）および血小板を長期保存することは、輸血および臨床医学において重要な意味を持つ。 Satpathy et al. 浸透圧の不均衡と40mMの細胞内トレハロース濃度をもたらしたリン脂質相転移を使用して細胞外培地からトレハロースとRbcをロードするための方法を説 Trehaloseはより長い期間のRbcの浸透保護を出すために見つけられました。再水和に続いてトレハロースロードRbcの凍結乾燥は、それらの形態の保持と55％の生存をもたらした。生き残った細胞はATPと2,3-ジホスホグリセリン（DPG）を合成し、メトヘモグロビンの低レベルを持っていた。凍結乾燥赤血球中のｓｏｄおよびカタラーゼの活性およびヘモグロビンの二次構造はすべて新鮮な赤血球の活性と非常に類似していた。この研究は、トレハロース負荷がヘモグロビンの安定化のために必要とされ、赤血球の凍結保存に向けた重要なステップを提供したことを示した。

血液バンクにおけるヒト血小板の正常な貯蔵時間は、それらが廃棄されるまでの5日であり、輸血に必要な血小板が慢性的に不足している。より長い期間の血小板の凍結保存に向けた努力として、Wolkers et al. ヒト血小板の細胞質にトレハロースを導入する方法を記載した。 Trehaloseは37°Cの人間の血小板によって50%以上のローディングの効率と容易にuptakenあるために見つけられました。 Trehalose荷を積まれた血小板の凍結乾燥そして再水和は85%の残存率のそのままな血小板の優秀な回復で起因しました。これらの血小板はトロンビン，ＡＤＰ，コラーゲン，リストセチンなどのアゴニストに対して新鮮な血小板とほぼ同じ方法で反応した。トレハロース負荷血小板の膜マイクロドメインと蛋白質成分は凍結乾燥と再水和後にそのまま維持された。

トレハロースの保護効果は、乾燥した角膜上皮細胞においても実証された。培養した角膜上皮細胞をトレハロースでプレインキュベーションした後，乾燥した細胞の割合は対照培地と比較して有意に減少した。保護効果はまた、トレハロースとインキュベート組織が目に見えて滑らかであった脱核ブタの目でex vivoで確認されました。これらの結果は，眼科におけるトレハロースの有用性とドライアイ症候群の点眼薬としての応用の可能性を示している。

細胞小器官の凍結保存にトレハロースを使用することがYamaguchi et al.、凍結したmitochondriaのためにcryoprotectantとしてtrehaloseを使用したかだれ。トレハロースの存在下で凍結したミトコンドリアは、ミトコンドリア外膜（MOM）の完全性と新鮮なミトコンドリアのものと同様のBcl-2ファミリータンパク質超微細構造，ＡＴＰ合成，膜貫通ポテンシャル，カルシウム誘起膨潤，前駆体蛋白質の輸入と処理もトレハロースの存在下で保存された。これは頻繁に漏れやすくなるmitochondriaを凍らせるために使用される標準的なショ糖マンニトールの緩衝とは違ってあります。従ってtrehaloseはmitochondriaの生物的特徴のほとんどを保て、trehalose凍らせていたmitochondriaはお母さんの完全性に頼る他のmitochondrial機能およびapoptosisの研究に使用することができます。

トレハロースは、長期間にわたって臓器の保存に使用されてきました。内皮細胞および血管系の性能に影響を与えることなく、イヌ肺を>30時間保存するためのWadaのグループによって”ET-Kyotoソリューション”が開発されました。ワクチンおよび抗体の延長された安定化そして保存はまたtrehaloseを使用して達成されました。