相互主義の症候群はナマケモノの生活様式を強化する

はじめに

哺乳類の間では草食動物が優勢な採餌戦略であるが、樹上の草食動物は非常にまれである。 実際、すべての哺乳動物属の4％未満がある程度樹木性および草食性である種を含み、10種の哺乳動物（または哺乳動物の多様性の0.2％未満）のみが特化した樹木性草食動物と考えられている。 木の植物の問題で飼料を与える種は非常に限られた生活様式を所有しています。 一方では、それらはおおいで支えられるために小さく、軽くなければならない;一方では、小さいボディサイズは繊維で豊富しかし消化できる栄養素で低 したがって、樹木の草食への進化は、霊長類、樹木のナマケモノ、有袋類を含む分類学的に異なる哺乳類のグループに見られますが、すべての重量は1-14kg したがって、このライフスタイルの希少性と草食性および樹上性哺乳類の間の体の大きさの収束は、体の大きさに対する栄養エネルギーの制約を反映しているようである。 このような制約を克服するために、樹木の草食動物は劇的な解剖学的（例えば、反芻動物のような胃前消化器官）、生理学的（例えば、代謝率の低下）および行動的（例えば、厳格な食餌選好）適応を進化させた。

ナマケモノ、またはスペイン語でlos perezosos（’lazies’）は、ゆっくりと動く新種の哺乳動物です。 二つの系統群、二つ-（Choloepus spp.）および三足指（Bradypus spp.）ナマケモノ（図1a、b）は、約40Maで分岐し、生態学的に全く異なっています。 いずれも中型の前腸発酵樹上哺乳類であるが、二足歩行ナマケモノは比較的大きな家庭範囲（、最大140ha）と動物、果物、葉の比較的多様な食事を持っているのに対し、三足歩行ナマケモノは非常に制限された家庭範囲（範囲=0.3-15.0ha）を持っており、厳格なfolivoresとみなされている。 さらに、個々の3つのつま先のナマケモノは専門家であり、森林内のわずかな樹種からの葉をねぐらにして消費しています。 彼らの栄養的に貧しいと有毒な食事のために、三つま先ナマケモノは、任意の哺乳動物のための消化の最も遅い速度を持っています。 この低エネルギーの発生を説明するために、3つのつま先のナマケモノは非常に低い代謝率を持ち、その質量に予想されるものの半分以下です。

約一週間に一度、三本のつま先のナマケモノが天蓋からモーダルツリーの基部に降りて、そこで彼らは痕跡の尾で地面に窪みを作り、糞を堆積させる。 排便後、ナマケモノはトイレを葉のごみで覆い、キャノピーに上昇する。 二足のナマケモノは、（彼らが頻繁に行う）木を切り替えるときに、特に、キャノピーから、または地面に排便し、そのルーチンは、周波数とサイトの忠実度の両方の面で、はるかに少ない制約されています。 木を降ろすことはあらゆるナマケモノのために危険、精力的に高価である。 私たちが文書化したすべての大人のナマケモノの死亡者の半分以上は、ナマケモノが地面にいたとき、またはその近くにいたときの堕落事象でした。 さらに、キャノピーから排便するために下降する平均コストは、ナマケモノの毎日のエネルギッシュな予算の約8％を占めると推定している（詳細は電子補 ナマケモノが林床で排便するリスクと精力的なコストが高まっていることを考えると、それは重要なフィットネス強化行動であることが期待され 三足のナマケモノに対するこの行動の示唆された利点には、好みの木を肥やすこと、トイレを介して他のナマケモノと通信すること、または捕食者からの検出を避けることが含まれる。 木のナマケモノの生活様式によって課される栄養上の制約を考えると、我々はこの行動が不可解でありながら重要な栄養入力によって駆動される可

両種のナマケモノは、藻類、節足動物、忌避性真菌など、毛皮に共生する微生物の多様な集合体を保有しており、その多くはナマケモノの毛皮に存在するphoretic生態系内にのみ存在している。 緑藻類（Trichophilus spp.）は特に豊富である。 三足のナマケモノの個々の毛は、毛の軸が雨水で飽和することを可能にする独特の横方向の亀裂を有し、藻類はその後、植民地化し、水耕栽培する。 共生関係はまた、ナマケモノとピラリッドガ（Cryptoses spp.）、蛾は協会（+）を必要とするが、彼らはナマケモノを食べていないので、彼らのホストには結果（0）を課すことはありません。 ナマケモノが木を下りて排便すると、グラビッドのメスの蛾はナマケモノと産卵を新鮮な排泄物に残します。 幼虫は糞の中で完全に発達し、成虫が出現してキャノピーに飛んで、ライフサイクルを続けるためにナマケモノの毛皮で彼らの交配地を求めます。 三足のナマケモノは定期的にオートグルームが、彼らはナマケモノの蛾を除去するのに効果がありません。 ピラリッドガのライフサイクルは、三足のナマケモノにおけるこれらのそうでなければ不可解な行動に完全に依存しているので、我々は、蛾とナマケモノの相互作用が実際にナマケモノも彼らの関連（+/+）のおかげで恩恵を受けている重要な相互主義である可能性があると仮定した。

相互作用—異なる種のメンバー間の共同的に有益な相互作用—は、自然界に遍在しており、すべての生態学的相互作用の中で最も重要なものの一つです。 複数の種の間での拡散および間接的な相互作用から緊密に共存する直接的な相互作用に至るまで、mutualismsは以前に、クライアントのサンゴ礁の魚から外部寄生虫を除去する”クリーナー魚”、またはアカシアの木を守るアリなど、そうでなければ説明できない行動を説明するために呼び出されており、栄養的に制限された生物が葉カッターアリの菌類システムで観察されるような食料源を栽培し維持するメカニズムとして呼び出されている。 ナマケモノが蛾のために耐えているように見える表面的には報われないリスクを考えると、以前はナマケモノとの共生関係を持っていると信じられていたphoretic symbiontsは、実際には彼らのホストに栄養入力を提供することによってこの関係を強化していたと仮定した。

ナマケモノとそのphoretic symbiontsとの関係を探るために、我々は成体の二、三足のナマケモノを捕獲し、各個体に寄生するpyralid蛾の数だけでなく、無機窒素とリンの濃度、毛皮上の藻類バイオマスなどのナマケモノの毛皮内の他の重要な生態系成分を定量化した。 また、毛皮内のコミュニティメンバーが消費されているかどうかを判断するために、ナマケモノの森林からdigestaを収集しました。 三足のナマケモノで観察された剛体挙動は蛾の侵入を促進し，蛾の密度は二足のナマケモノに比べて大きいと予測した。 我々はさらに、蛾はこの生態系への外因性有機材料の唯一のポータルの一つであるため、蛾の密度を高めることはナマケモノの毛皮内の栄養の利用可能性と生産性を促進し、潜在的にこの特殊な樹木草食動物が直面する制約のいくつかを緩和するための栄養入力を提供すると予測した。

材料と方法

(a)ナマケモノの生態系を記述する

コスタリカのサンホセの北東約85km（北緯10.32度、西経-83.59度）のフィールドワークを行った。 茶色の喉の三つのつま先のナマケモノ（Bradypus variegatus）とHoffmannの二つのつま先のナマケモノ（Choloepus hoffmanni）は、私たちの研究サイト全体で比較的豊富です。 フィールドワークは、ウィスコンシン大学マディソン校によってiacucプロトコルA01424によって規定され、承認されたように実施され、アメリカ哺乳動物学会 アクセスは私有の地主によって許可され、私達のプロジェクトおよびサンプルコレクションはMinisterio de Ambiente、Energia y Telecomunicaciones、Sistema Nacional de Áreas de Conservación、コスタリカによって承認された。 すべてのサンプルは、CITESおよび米国魚類野生生物局の承認を得て米国に輸入されました。 ガと藻類のコミュニティを文書化するだけでなく、ナマケモノの毛皮の無機窒素とリンのレベルを定量化するために、我々は以前にマークされた大人の二（n=14）と三つま先（n=19）ナマケモノを2012年に標準的な手順に従って捕獲した。 若いナマケモノはしばしば藻類を欠いており、母親から藻類コミュニティを獲得しているように見えるため、分析に少年は含まれていませんでした。 私たちは、各ナマケモノの背から髪のロックをカットし、無脊椎動物の真空でナマケモノからすべての蛾を集めました。 平均して、我々はそれぞれ15.2（±2.9;範囲=4-39）と4.5（±1.3;範囲=0-21）三と二つま先のナマケモノから蛾を収集しました。 無機窒素およびリンの濃度を定量するために、我々はナマケモノ毛皮の（0.1g）をサンプリングし、15分間脱イオン化水の15mlでそれを洗浄した。 洗浄を0.45μ mシリンジ膜フィルターを通して濾過し、フローインジェクション分析器（Quickchem8000FIA、Lachat Instruments）を用いて、＜8387＞＜7413＞インライン式＜3118＞および＜8387＞＜8198＞イン システマティック昆虫学研究所（USDA、農業研究サービス）で蛾（Cryptoses choloepi Dyar;Pyralidae：Chrysauginae）が同定された。 我々は、各蛾（±0.1μ g）を秤量し、ナマケモノの質量（±0.1μ g）で蛾の侵入の総バイオマスを分割した。1kg）体の大きさの個人差を説明するために、スケーリングがなくても、と蛾の数と総蛾バイオマスの両方との間に有意な関係が検出された（電子補足資料、図S1を参照）。

各ナマケモノの毛皮中の微生物バイオマスのクロロフィルa濃度を蛍光測定により測定しました。 手短に言えば、各ナマケモノからの0.01gの毛皮を、DDH2O1×およびメタノール3×中で超音波処理した（約1000g）。 各30分）毛皮から藻類細胞を分離するために（電子補足材料、図S2を参照してください）; 洗浄からの濾液を遠心分離し、蛍光光度計で測定し、クロロフィルの濃度を計算した。 藻類バイオマスの我々の推定値は、超音波処理後の毛皮の質量の変化（すなわち、藻類除去後の毛皮の質量の減少は、クロロフィルa濃度に関連していた） 我々は、各サンプル中の藻類のバイオマスを近似するために、超音波処理後の毛皮の質量の変化を使用しました。 次に、ナマケモノの体重の20％が毛皮であり、洗浄による毛皮サンプルの観察された変化の割合が動物の表面積全体で一定であると仮定することにより、ナマケモノ全体の藻類の総質量を近似するために、サンプルからの藻類バイオマスの推定値をスケーリングした。 我々は、スケーリングされた蛾バイオマス、濃度と藻類バイオマスの違いをtテストで比較し、蛾バイオマスと、およびの間の関係を調べた。 種と予測子変数の相互作用は、蛾×種（t=1.09、p=0.28）と（t=1.40、p=0）の両方で有意ではなかったためです。図１ ７）に示すように、連続変数（例えば、蛾バイオマスまたは＜１ ２ ３ １＞＜１ ７ ８ １＞インライン式＜６ ３ ８ ８＞）を有する単純線形回帰モデルを報告した。

(b)in vitro発酵実験

前胃微生物発酵からの毛皮中の藻類の有機酸への消化率を定量化するために、in vitro発酵は、様々な植物成分を分解する能力を有する容易に入手可能な微生物群集であるルーミナル接種物を用いて行われた。 接種物は、２頭のＨｏｌｓｔｅｉｎ乳牛（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）から合成され、１リットル当たり１ｇのトリプチカーゼペプトンを含有する還元緩衝液を使用して、圧搾されたルーメン液を５． 発酵は、二（n=10）と三つま先ナマケモノ（n=10）から空気乾燥ナマケモノ毛皮の150mgを含んでいた5mlのガラス血清バイアル（Wheaton Scientific）で実施した。 発酵に藻類や有機物の寄与を評価するために、我々は同じナマケモノから毛皮のバイアルが含まれていたが、藻類や他の関連する有機物を除去するた ルーメン接種物と還元緩衝液のみを有する四つのブランクバイアルも分析した。 バイアルは、最初にCO2で2分間激しくガス化され、その後、#00ブチルゴム栓でしっかりと密封されました。 希釈されたルーミナル接種物（2.00ml）をCO2ガス処理下に加え、バイアルをフランジ付きブチルゴム栓で密封し、アルミニウム圧着シールで固定した; これらの接種は、希釈されたルーメン液の温度平衡化の後、３ ９℃の部屋で行った。 約0、1、2、4および16時間で激しい手の揺れを除いて、バイアルは振盪することなく直立位置でインキュベートした。 24時間のインキュベーションの後、バイアルをキャップ解除し、1.00mlの脱イオン水を加えた。 液体内容物をマイクロピペッターで数回混合し、1.00mlの液体を微小遠心分離のために除去した（12,000×g、10分、4℃）。 上清をＨＰＬＣによって有機酸について分析した。 個々および総揮発性脂肪酸（vfa;ブランク中の濃度の減算後）の純生産は、クラス変数、種×処理相互作用としてナマケモノ種と毛皮処理（洗浄対未洗浄）とsas v.9.2の混合モデルによって分析された、およびランダム変数として個々の動物と。 データ（電子補足材料、表S1を参照）は、主に炭水化物発酵から誘導されたC2–C5直鎖VFA（吉草を介して酢酸）は、洗浄された毛皮からよりも洗われていない毛皮 対照的に、分岐鎖VFA（イソ酪酸、2-メチル酪酸および等吉性）の生産は、一意にアミノ酸発酵（具体的には、分岐鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシンおよびバリン）に由来する、低く、種間または処理（p>0.30）と異ならなかった、藻類タンパク質の胃前発酵のための最小限の容量を示唆している。

(c)藻類および植物の組成分析

二つ（n=10）および三つま先（n=10）ナマケモノの毛皮から抽出された藻類サンプルの炭水化物、タンパク質、脂質、および最も一般的に消費される六つの植物種の葉サンプルの組成分析を乾物content有量の割合として実施した。 炭水化物およびタンパク質分析のために、試料（1〜7mg、0.001mgに秤量）を200〜600μ lの0.2M NaOHに懸濁し、80℃で40分間加熱し、反転による頻繁な混合を行い、室温に冷却した。 0で中和した後。38体積の10％（v/v）氷酢酸、タンパク質は、リゾチームを標準としてCoomassie Plus reagent（BioRad）を用いてBradford法によってアッセイされ、炭水化物はグルコースを標準として用いてフェノール-硫酸法によって分析された。 脂質の抽出のために、空気乾燥させた（60°C）藻（およそ。 50mg)および葉(100-200mg)を、テフロンライナー付きスクリューキャップ管中の2mlのChcl3、2mlのメタノールおよび1mlのH2Oに懸濁した。 ２分間ボルテックスした後、チューブを遠心分離し（２ ５ ０ ０×ｇ、１ ０分間、室温）、クロロホルム相を回収した。 残りの物質をさらに３回抽出し、それぞれ２ｍｌのクロロホルムで抽出した。 ４つのクロロホルム抽出物をプールし、水中の飽和Ｎａｃｌ３ｍｌで処理した。 最終的な遠心分離の後、クロロホルム相を回収し、N2下で約0.5mlの体積まで蒸発させた。 濃縮された抽出物を定量的にchcl3洗浄でpreweighed1.5ml microfugeチューブに移し、Chcl3を蒸発させた。 次いで、マイクロフージ管を、秤量する前に６ ０℃で一晩風乾した。 空の管が乾燥の空のmicrofugeの管の減量のために訂正するのに使用されていました。

(d)ナマケモノの消化器内の藻類の同定

我々は、藻類がナマケモノによって消費されていたかどうかを判断するために、胃gavageを介して二（n=16）と三足のナマケモノ（n=12）の森林から消化器を収集した。 我々は、大きな粒子を排除するために、60μ mのふるいを通してdigestaの2mlのアリコートを濾過した。 次いで、３ ０μ ｌの濾過ｄｉｇｅｓｔａを使用して顕微鏡スライドを調製し、４ ０ ０×倍率で化合物光学顕微鏡で各スライドを観察した。 我々は、各スライドの藻類またはシアノバクテリア材料の100細胞をカウントし、検出された各細胞を撮影しました。 藻類とシアノバクテリアは、可能な限り最高の分類学的分解能に同定され、代表的な藻類とシアノバクテリア群が撮影された（電子補足材料、図S3を参照）。

我々は、消化器で検出された藻類群集を、二（n=5）および三つま先（n=5）ナマケモノの毛皮上の藻類群集と比較した。 これらの個体からの毛皮を、１ｍｌのＤＤＨ２Ｏを含有する微小遠心管に入れ、１時間浸漬し、１ ５分間毎に５分間攪拌した。 上清を顕微鏡マウントのために使用しながら、毛皮をバイアルから除去した。 顕微鏡スライドを、３ ０μ ｌの上清を用いて調製し、４ ０ ０倍の倍率で化合物光学顕微鏡を用いて観察し、上記のように同定した。 各スライドから100藻類とシアノバクテリア細胞の写真を収集しました。

結果と考察

予測されたように、3頭のナマケモノは2頭のナマケモノよりも多くの蛾（図1c）を保有しているだけでなく、の濃度が高く（図1d）、毛皮中の藻類のバイオマス（図1e）が増加していた。 我々は同様の傾向を見出したが、種間のまたは総リン（主にの形）で有意な（p>0.05）差は検出されなかった（電子補 しかし、土壌で一般的に観察されるように、これらの栄養素は光合成生物によって急速に獲得されるか、または雨水の間に浸出する可能性が高い。 ナマケモノの種類にかかわらず、濃度は毛皮中のピラリドガの数と正の関係があり（図2a）、藻類のバイオマスもナマケモノの毛皮中のの濃度とともに増加した（図2b）。

我々は、ナマケモノが平均して毛皮中の微生物バイオマス（主に藻類）の125.5g（±14.8g、±1s.e.）を保有していると推定しており、これは体重の約2.6％（±0.2％）に変換される。 我々のin vitro発酵実験では、ナマケモノの毛皮の藻類も非常に消化可能であること、藻類の消化からのVFA生産は主に炭水化物発酵に関連していること、および三つま先のナマケモノの毛皮には、前胃発酵から24.4mgのVfa*（g fur-1）を得るのに十分な有機材料が含まれていることが明らかになった（electronic supplementary material、表S1参照）。 ナマケモノが好む植物種の藻類および葉の組成分析は、両方の項目が炭水化物が豊富であることを明らかにした（25。藻類の場合は7％±1.4、植物の場合は42.4％±3.5;電子補足材料、表S2を参照）、および同等量のタンパク質を保有していた（5.0％±0.39）。 しかし、植物の葉と比較して、微細藻類は、脂質content有量が三から五倍豊富であった—二、三つま先ナマケモノからの藻類は、それぞれ45.2％（±4.0）と27.4％（±0.8）脂質であった（電子補助材料、表S2を参照）。 微細藻類の脂質含量は無機窒素レベルと逆に関連しており，これはナマケモノ種間の藻類の脂質含量の違いを説明することができる。 それにもかかわらず、この高い脂質の構成が付いている食品は脂質がpregastric発酵プロセスを普通とばすので、ナマケモノに（グラムごとの蛋白質か炭水化物と比較される二度に）特に豊富および急速なエネルギー源を提供する。

当然のことながら、同じ種の藻類が、二足指と三足指の両方のナマケモノの毛皮と消化器に発生しました。 具体的には，Ｔｒｉｃｈｏｐｈｉｌｕｓｓｐｐを同定した。 三足のナマケモノのうち二つ（または17％）とサンプリングされた二足のナマケモノの六つ（または38％）の消化では、この共生藻はナマケモノの毛皮に生息することしか知られていない（電子補足資料、図S3を参照）。 藻類は容易に消化できるが、限られたサンプルサイズで検出されたという事実は、摂取された藻類の頻度が高い可能性が高いことを示唆している。

結論

私たちのデータは、ナマケモノ、蛾、藻類の間で一連の関連した相互作用が起こることを示唆しています（図3）。 具体的には、ナマケモノは、捕食リスクの高まりと多大なエネルギーコストに直面しても、木の根元に下降して蛾のライフサイクルを助け、排便するこ ナマケモノの毛皮の中の蛾は、順番に、ナマケモノの毛皮の中の生態系を周囲の環境に結びつける栄養素のポータルとして機能します。 ナマケモノの生態系の中では、真菌が一般的であり、我々は蛾が分解者のこの豊富なコミュニティによって鉱化されていると仮定しています。 あるいは、蛾は有機廃棄物を糞の山から毛皮に直接輸送することができます。 メカニズムにかかわらず、蛾のバイオマスの増加は無機窒素レベルを増加させ、ナマケモノの毛皮上の藻類群集の成長を増強するように見えた。 ナマケモノは、栄養上の利益のために、おそらくオートグルーミングを介して、藻類を消費します。 私たちのVFAと組成データは、ナマケモノの毛皮上の藻類が特に消化可能な炭水化物と脂質が豊富であることを示唆しています。 要するに、ナマケモノが三方相互主義から派生した”藻類庭園”を放牧していることを提案しています（図3）。

栄養を提供することに加えて、藻類の栽培はカモフラージュを介してナマケモノの生存を促進し、空中捕食者からの死亡率を低下させる可能性がある。 藻類栽培のこれら二つの究極のメカニズムは相互に排他的ではないが、我々は藻類によって提供される迷彩は栄養補給に二次的であると推測する。 第一に、キャノピー内の隠蔽の増加の利点は、排便するために木を降りるときに遭遇する高い捕食率を相殺するために非常に強くなければならないが、藻類–ナマケモノの共生は、ナマケモノの主要な空中捕食者であるハーピーイーグル（Harpia harpyja）の分布とは無関係であるように見える。 第二に、以前に構築された3足のナマケモノのエネルギー予算は、毎日のエネルギー消費が実際に摂取量を超える可能性があることを示唆しています。 行方不明の食料源は、消毒された捕虜施設で三本の指のナマケモノが十分に栄養を与え続けることが困難である理由を説明するのに役立つだろう。 最後に、より曖昧で制限されていない飼料である二足のナマケモノに関連するmutualismsは、より曖昧であった。 二足のナマケモノは、おそらく森林の天蓋で同様の捕食圧力に直面しているにもかかわらず、有意に少ない蛾と少ない無機窒素と藻類を持っていた。 確かに、同じ地理的領域からの二、三足のナマケモノは、Trichophilus sppの系統発生的に異なるグループを港にしています。、ナマケモノとその藻類のコミュニティとの間の長い共進化の関係を示唆している。

藻類がナマケモノに与える利点が何であれ、この複雑な相互作用の症候群—蛾、ナマケモノ、藻類の間で—は、リンクされた相互作用を維持するために増加した捕食リスクに直面することを必要とする進化的トレードオフに三足のナマケモノをロックしているように見える。 蛾のライフサイクルをサポートすることは、なぜ三つま先のナマケモノが少数のモーダルな木に高い忠実度を持ち、ナマケモノにとって森林の最も危険な部分であるものに排便する顕著な意欲を持っているのかを説明するかもしれません。 これらの相互作用は、脊椎動物の中で最も制約があり希少な採餌戦略の1つである樹木草食動物としてのナマケモノの成功にも寄与する可能性があ 私たちの研究は、生理学的および解剖学的適応に加えて、ユニークな生態学的相互作用が樹木や草食的なライフスタイルを促進する可能性があることを示唆している最初のものです。ナマケモノ、蛾、藻類の間の相互作用のメカニズム的なつながりと推定上の利点をテストする将来の実験は、これらのつながりの正確な性質を離れていじめるのに役立ちます。

資金調達声明

資金調達は、国立科学財団（DEB-1257535）、ミルウォーキー公共博物館、ウィスコンシン大学マディソン校、アメリカ哺乳類学会によって提供された。

脚注