腫瘍学レポート

はじめに

新しい治療法が先進前立腺癌の治療のための臨床実践に最近導入されているが、前立腺癌は2014年に米国の男性で第二のdeadliestcancerのままである(1)。 新しい治療上のターゲットおよびstrategiesareは更に前立腺癌を持つ臨床結果のofpatientsを改善するために緊急に必要としました。

有望な潜在的な治療標的の一つは、サイクリン依存性キナーゼ5（CDK5）である。 CDK5は、他のCdkと構造的に類似したセリン/スレオニンキナーゼである(2)。 CDK5は、細胞周期調節における主要な役割を持っているようには見えない（3,4）。 Ithasは役割のinneuronal移動、微分および付着を含む中枢神経系のthedevelopmentの支配的な役割のために、よく特徴付けられました（5,6）。 その後、CDK5が癌の発生と転移（7-12）に重要な役割を果たすことが示された。 Prostate癌細胞では、我々はCDK5が転移（7）のために、重要なforcytoskeletal整合性、細胞の移動と浸潤、およびinvivoであることを実証しました。 膵臓癌では、CDK5は、このように変異KRAS腫瘍（8）のための潜在的な”ドラッグ可能な”ターゲットをproviding、中心的に重要なRALシグナル伝達経路を介してKRASシグ 一緒に、これらの研究は、単独で、または他の薬剤との組み合わせで、CDK5の阻害は、これらおよび他の癌タイプのための効果的な治療戦略を提供する

本研究では、前立腺癌細胞におけるCdk5阻害との組み合わせにおいて特に有効である薬剤を同定することに着手した。 そこで，Ｊｏｈｎｓｈｏｐｋｉｎｓ薬物ライブラリー（ＪＨＤＬ）のａｓｃｒｅｅｎを行った。 JHDLは、3,360種類の医薬品化合物で、様々な用途でヒトにおける安全性試験に成功している（13,14）。 このライブラリは、Hif1A阻害剤（15）としてジゴキシンの同定、およびアンジオゲネシシンヒビター（16）としてイトラコナゾールを含む癌治療のための化合物の再利用に成功している。 我々は以前にjhdlを使用して、低レベルの転移抑制遺伝子N-mycdownregulated遺伝子1（NDRG1）（17）を発現する前立腺癌に対する抗腫瘍活性の増加を伴う臭化セトリモニウムイリノテカンアスコンパウンドを同定した。ここでは、CDK5活性が異なる前立腺癌細胞と同様のJHDLスクリーニングを行った。 Tiloroneはin vitroの総合的な致死性incdk5不十分な前立腺癌の細胞とacompoundとして識別されました。

材料および方法

細胞培養

pc3前立腺癌細胞株をatccから得た。 これらの細胞は、62歳の前立腺癌患者からの骨転移に由来する。 J.Isaacs博士によって提供されたヒト前立腺線維芽細胞は、Gleasonスコア4のa62歳の前立腺癌患者の前立腺生検から得られた。 両方の細胞株を成長させ、１ ０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ−１ ６ ４ ０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地中で維持した。 細胞を37℃の加湿インキュベーターで5％Co2Atmosphereで培養した。

PC3Cdk5Dn細胞株の作成

CDK5機能の損失は、d144Nmutationを含むドミナントネガティブ構築物のトランスフェクションによってPC3細胞で達成された、l.H.Tsai博士（ハーバード-メディカル-スクール）（18）によって親切に提供された。 使用されるプロトコルは、以前に説明されています(7)。 Ｓｃｈｕｅｂｅｌ（ｊｏｈｎｓ Ｈ Ｏｐｋｉｎｓｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏ ｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）により親切に提供された）を有する双方向Ｔｅｔベクター、ｐｂｉ−ＥＧＦＰ（Ｂ Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にサブクローニングした。 ＰＢＩ−ＥＧＦＰ空ベクターまたはＰＢＩ−Ｅｇｆｐｃｄｋ５Ｄｎベクターを、ＡＴＥＴ−Ｏｆｆプロモーター構築物、ＰＴＴＡ（Ｂ Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有するＰＣ３細胞にトランスフェクトした。

ウェスタンブロッティング

ウェスタンブロッティングは、以前に記載されているように実行されました(19)。 蛋白質の十マイクログラムをゲル上にロードした。 一次抗体をブロッキング緩衝液に溶解した。 抗ＣＤＫ５（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のために１：１，０ ０ ０希釈を使用し、抗ビンクリン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｕｐｓｔａｔｅ）を１：４，０ ０ ０希釈した。 二次抗体は、ａｔ ａ１：４，０ ０ ０希釈で希釈した。 バンド強度の正規化は、家政婦タンパク質ビンクリンを用いて行われた。 開発されたブロットはMicrotekスキャナを用いてスキャンされた。

創傷治癒アッセイ

創傷治癒アッセイは、confluentpc3コントロール（空のpBI-EGFPベクターを含む）またはPC3Cdk5Dncellsを用いて行った。 ゴム先端のスクレーパーを使用して、セルの領域をこすり落としました。 光学顕微鏡画像はすぐに撮影され、24hafterスクレイピングされました。

小分子ライブラリースクリーニング

JHDLライブラリーは、以前に記載されています(13,14,17)。JHDL化合物の貯蔵およびスクリーニングは、以前に記載されたように行われた（17）。簡潔に述べると、ＰＣ３対照およびＣｄｋ５Ｄｎ細胞を９ ６ウェルプレート（１×１ ０ ３細胞／ウェル）に播種し、一晩付着させた。 次いで、２ ０ ０μ Ｍ ＩｎＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏのストック溶液として保存された５μ ｌの薬物を、ＲＰＭＩ培地を完成させるために添加し、その結果、細胞を１ ０μ Ｍの最終濃度で処理した。 ４ ８時間の処理の後、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ９ ６（商標）Ａｑｕｅｏｕｓｎｏｎ−放射性細胞増殖アッセイからの２ ０μ ｌのＭＴＳ試薬を、３ ７℃で２〜４時間の期間、ｅａｃｈｗｅｌｌに添加した。 板を用い解析aSoftMax Proプレートリーダー（分子機器などがある。 処理された細胞の増殖を、ＤＭＳＯ処理されたＰｃ３ＣｏｎｔｒｏｌまたはＣｄｋ５Ｄｎ細胞（増殖指数）の増殖と比較した。 PC3Cdk5Dn細胞の増殖インデックスは、PC3コントロール細胞の増殖インデックスと比較しました。 PubMed研究は、潜在的なヒットの臨床的使用を評価するために行われた。

mtsアッセイ

MTSアッセイは、ティロロン治療の抗増殖効果を測定するために行われました。 チロロンジ塩酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、ＤＭＳＯ中の１ ０ｍ Ｍストック溶液として−２ ０℃で保存した。 １ ０ ０μ ｌの完全ＲＰＭＩ培地を含む９ ６ウェルプレート中に１ ０ ０ ０個のＰＣ３細胞をめっきした。 約50％の合流時に、チロロン二塩酸塩を投与した。 実験のために、化合物を、所望の最終濃度を得るために、完全なＲＰＭＩ培地中で希釈した。 ７ ２時間の処置（ティロロン単独療法）の後、ＭＴＳ試薬を添加し、Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを用いて４ ９ ０ｎｍでの吸収を測定した。増殖指数を計算し、未処理のＰＣ３対照ＯＲＣＤＫ５ＤＮ細胞（１ ０ ３μ ｌの完全ＲＰＭＩ培地中）を対照として使用した。 Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を実施してｐ値を評価した。

Clonogenic試金

clonogenic試金はtiloroneの処置の後で長期存続を査定するために行われました。 前立腺癌細胞を60mm皿に入れ、付着させた。 続いて、各ディッシュからの1×103細胞を三重in60mmディッシュにめっきし、完全なRPMI培地中で12日間インキュベートした。コロニーを固定し、90％メタノールおよび10％結晶紫色溶液（2.3％結晶紫色、0.1％シュウ酸アンモニウムおよび20％エチルアルコール;シグマ）を含む溶液で染色した。 コロニーはコンピュータスキャナ（Microtek）でスキャンされ、手動でカウントされた。Studentのtテストは、細胞株間の差が統計的に有意であったかどうかを評価するために行われました。

3D成長アッセイ

3D成長アッセイは、以前に記載されている（17）と同じプロトコールを使用して行われました。 要するに、スフェロイドは、完全なRPMI mediacontaining0.5％メチルセルロースのCO2インキュベーターでhumidifiedplate上の吊り下げドロップとして16時間PC3細胞を培養byculturing生成されました。 スフェロイドを、ｉｎｃｏｌｌａｇｅｎ ｍａｔｒｉｘ（Ｂ Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を埋め込み、ティロロンで処理し、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔ ｉ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｎｉｋｏｎ）を使用して、処理開始６日後の処理日に画像化した。 回転楕円体および総（回転楕円体プラス芽）領域をImageJで測定した。 倍の増加は、各個々の回転楕円体の6日目の回転楕円体/総面積を0日目の回転楕円体/総面積で割ることによって計算された。 各セル線と時間点について，四つのスフェロイドの倍増加を行った。 統計的分析は、Student’st-testsを使用して行った。

結果

CDK5活性の抑制

PC3前立腺癌細胞は、その高い転移性およびアンドロゲン独立性のためにJHDLcompound screenに選択され、それによって積極的なmetastaticcastrate抵抗性前立腺癌に似ていた。 CDK5活性は、トランスフェクションとドミナントネガティブ変異（CDK5144N）の選択によって阻害された。 これらのＰＣ３Ｃｄｋ５Ｄｎ細胞は、ＰＣ３対照細胞（空のベクターで形質移入されたＰＣ３細胞）と比較して、より高いｔｏｔａｌｃｄｋ５のタンパク質レベルを有していた（図２Ｂ）。 1A）。 Ａｗｏｕｎｄ ｈ ｅａｌｉｎｇ ａｓｓａｙ（８）は、ＣＤＫ５がこれらの細胞において機能的に不活性であることを確認した；Ｐｃ３Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞とは異なり、ＰＣ３Ｃｄｋ５Ｄｎ細胞は掻き取られた表面積に侵入す1B）。

CDK5活性に基づいてpc3細胞を標的とする化合物のライブラリスクリーン

cdk5活性に基づいてPC3細胞を標的とする化合物を選択するために、ハイスループットスクリーニングアッセイを行った。 ＰＣ３ＣｏｎｔｒｏｌおよびＣｄｋ５Ｄｎ細胞を、ＪＨＤＬの全ての化合物で１ ０μ Ｍで４ ８時間処理した。 ＣＤＫ５発現に基づいてＰＣ３細胞を選択的に標的とするヒットを同定するために、本発明者らは、増殖指数比（Ｃｄｋ５Ｄｎ／対照）が０． 2A）。さらに、細胞増殖を阻害する化合物（グラフ中の水平線および垂直線）に特に関心があったため、hitsはPC3細胞の細胞増殖を少なくとも10％阻害しなければ Wealsoは、inpc3細胞の細胞増殖を70％阻害するすべての化合物（グラフの左下隅）を選択し、潜在的な非常に有効な抗腫瘍剤を同定することに興味があった。 合計で、41のヒットは、さらなる評価のために選択されました。＜８ ２ ５ ６＞＜７ ０ ２ ４＞一次画面から選択したｈｉｔを４ ８時間１ ０μ ＭでＰｃ３ＣｏｎｔｒｏｌおよびＣｄｋ５Ｄｎ細胞に３回添加して偽陽性を除去する二次画面を実施した（図３）。 2B）。 カットオフ値はプライマリスクリーンよりもわずかに厳密ではなく、増殖指数（Cdk5Dn/コントロール）の比が0.7以下または1.4以上であったときにヒットを考慮した化合物であった。 これにより、cdk5発現PC3細胞を選択的に標的とする三つの化合物が同定された。: ルチランチン、乳酸エタクリジン、塩化セタルコニウム( 2C）。これらの化合物は抗腫瘍剤としては使用されておらず、静脈内抗腫瘍剤としての潜在的な臨床的使用は制限されているようである（20-23）。 別の化合物、チロロンanalogr9536-DAは、両方の等原性PC3細胞株（>70％阻害）を阻害するのに非常に有効であったが、Pc3Cdk5Dn細胞の増殖を幾分効果的に阻害した（比Cdk5Dn/対照：0.687）。 Tiloroneおよび類似体にインターフェロンの誘導剤（24-26）として少なくとも部分的に機能する抗ウイルス性の活動があり、antitumoractivityがまたあるためにpreclinicallyそして臨床的に示されていました（27,28）。

チロロンはCDK5活性の低いPC3細胞を選択的に標的とする

新たに溶解したチロロン二塩酸塩を用いた実験を続けた。 様々な濃度での７ ２時間のチロロン処理の後、そのＩＣ５ ０は、ＭＴＳアッセイにおいてＰＣ３Ｃｄｋ５Ｄｎ細胞では８〜１ ２μ Ｍ、ＰＣ３対照細胞では１ ５μ Ｍで確立された（図１Ｂ）。 3A）。 8μ mでは、増殖活性は、それぞれ、PC3コントロールとCdk5Dncellsで24と47％減少した（p=0.001）。 正常な前立腺細胞のチロロンの毒性を評価するために、ヒト前立腺線維芽細胞のチロロン処理を用いてＭＴＳアッセイを実施した（図１Ｂ）。 3B）。 これらの細胞のtotiloroneの感受性はPC3対照細胞のそれに類似していました。

PC3細胞におけるティロロンの阻害効果は、クローン原性アッセイを行うことによってさらに評価された（図。 3C）。 PC3Cdk5Dn細胞は、このアッセイでチロロンにPC3コントロール細胞よりもalso significantlyより敏感であった。 10μ mティロロンでの処理は、PC3Cdk5Dn細胞で40％とPC3コントロール細胞で72％のクローン生成生存をもたらした（p=0.002）。

スフェロイド増殖アッセイを実施して、ティロロン処理時の3dTumor増殖およびPC3細胞の浸潤を評価した（図10B）。 4). PC3コントロールとPc3Cdk5Dn細胞の両方がsix daysにわたって回転楕円体のサイズに匹敵する増加を持っていた。 しかし、総サイズ（スフェロイド＋芽のサイズ）は、ＰＣ３対照細胞のより高い倍の増加を有し、未処理のＰＣ３Ｃｄｋ５Ｄｎ細胞がＰＣ３対照細胞と比較して減少した侵襲性の可能性を有することを確認した。 ティロロンを5μ mで投与した場合、PC3対照スフェロイドは、未処理のPC3対照細胞と同様の増殖および侵襲パターンを有していた（p=0.59）（図10B）。 図4B、左グラフ）。 しかし、同じ濃度でPC3Cdk5Dncellsに投与されたとき、スフェロイドサイズと総サイズの両方の有意な減少が観察され（p<0.01）、ティロロンが5μ mで投与されたときにスフェロイドの成長とPC3Cdk5Dn細胞の浸潤を正常に阻害することを示唆している（図。 図4B、右グラフ）。 10μ mでは、両方の等原性細胞株は減少した侵襲性の可能性を有していた。

ディスカッション

よく特徴づけられた医薬品化合物のライブラリーであるJHDLは、薬物再利用研究を容易にするために開発されました（29）。 ライブラリ内の化合物の広範囲のin vivo毒性および薬物動態プロファイルは、これらの化合物の迅速なその後の開発を可能にする。 JHDLからの複数の混合物は癌および他の治療上の適用（13,14,16,17,30–32）のための臨床試験にadvancedtoでした。

本研究では、CDK5阻害の存在において癌細胞の増殖を差動的に阻害するJHDL forcompoundsをスクリーニングしました; tiloroneおよびtiloroneのアナログは選択式にCDK5不十分なPc3Prostate癌細胞を目標とする代理店として確認されました。 チロロン（Amixin IC）は、経口活性抗ウイルス剤として臨床的に使用されている国もある（25）。 ティロロンは、脳神経膠腫、喉頭乳頭腫症および乳癌（28,33,34）の治療のためにヒトで試験されている。抗腫瘍効果が報告されたが、ティロロンforcancer療法への関心は沈静化しています。 最近、Zhouらは、改善された抗癌活性を有する新しいtilorone類似体を報告した（35）。 これらの類似体は、特にCDK5阻害と組み合わせて、アミンを有望である可能性がある。

チロロンがCDK5阻害と組み合わせて有望である可能性に加えて、チロロンがcdk5阻害の有効性を増強する潜在的なクラスの薬物を示唆している。 Tiloroneはaninterferonの誘導剤として特徴付けられました（24）。 これは、インターフェロン自体、またはTLRアゴニストのような代替のインターフェロン誘導剤がacdk5阻害剤と組み合わせて有用である可能性があることを示唆している。 それにもかかわらず、他のメカニズムが関与する可能性があります。 例えば、tiloroneはDNA intercalating代理店同様にであり（24）、クロマチンの構造および遺伝子発現を調節するmaymodulateことを想像するかもしれません。 シグナル伝達経路および転写因子相互作用（36,37）を含むチロロンの他の機能も関与している可能性がある。 それ以上のstudiesareはWHICHTILORONEが選択式にCDK5否定的な前立腺のcancercellsを目標とする行為の厳密なメカニズムを解明するために必要としました。

謝辞

著者はP.J.Van Diestand E教授に感謝したいと考えています。 彼らのサポートと議論とProfessorsMのためのファン*デル*ウォール。A.CarducciとJ.T.Isaacsは、研究室の提供のために材料。 この研究は、Flight Attendant MedicalResearch Institute、NCI R01CA085567、R01CA134767、DOD grantw81xwhによってサポートされました-06-1-0139 そして、NCIスポーツの付与P50CA58236. M.D.W.はSaal van ZwanenbergstichtingとHuygensScholarshipプログラムによって支援されました。