この研究は二つの段階で構成されています:ステージ1は募集とスクリーニングが含まれ、ステージ2はビタミンDおよびn-3lcpufaランダム化、二重盲検、プラセボ対照試験（fig. 1). 介入の期間は12ヶ月です。
研究デザインの概略図。 1blood biomarkers:25-hydroxyvitamin D(25(OH)D)、赤血球(RBC)の脂肪酸、カルシウム、アルブミン、鉄の調査、ビタミンB12、folate、完全な血計算およびビタミンA.のアンケート:sociodemographics、身体歴、食べる/食事時間の行動 2．社会的コミュニケーション機能，感覚的問題，異常行動（一次成果）; 胃腸症状（二次的転帰）、太陽への暴露および皮膚の色。 人体測定：体重と身長。 3血液バイオマーカー：25（OH）D、RBC脂肪酸、カルシウムおよびアルブミン。 アンケート：社会コミュニケーション機能、感覚的問題、異常な行動（主要な結果）、および食事/食事時間の行動および食事の質。 人体測定：体重と身長。 4blood biomarkers:25(OH)D、カルシウムおよびアルブミン。 *胃腸症状（二次的転帰）および投薬/サプリメントの使用/有害事象の発生率/サプリメントのコンプライアンスは、研究期間を通じて監視されます
ステージ1は、栄養状態（生化学的指標および食事摂取量）、人口統計および病歴に関する研究集団の包括的な説明の機会を提供する。 ステージ2は、ASD症状の軽減に対するビタミンD、n-3Lcpufaまたはその両方の補給の有効性を実証する。
参加者
この研究は、マッセイ大学とニュージーランドのワイテマタ地区保健委員会（WDHB）との共同研究です。 研究の基準を満たす子供の介護者は、WDHB発達コーディネーターによって最初のインスタンスでアプローチされます。
臨床的に有意な差を80%の検出力と5%の統計的有意性で示すためには、試験の各部門に42人の参加者（最低34人の参加者、および20%の潜在的な脱落率を可 パワー計算は、社会的応答性スケール（SRS）の総スコア、平均SRSおよび標準偏差105および24.7単位のASDを有する未治療の小児におけるベースラインからエンドポイン サンプルサイズは、以下の式を使用して計算されました:
$$ N=2{\alpha}/2K/{\left({\mu}_2\hbox{-}{\mu}_1\right))}^2 $$
ここで、Nはグループごとに必要なサンプルサイズ、αはSD、Kは定数（7.９は、８ ０％の検出力および５％の有意性を示す）であり、（σ２−σ１）は、群間のＳＲＳ合計スコアの差である。
この研究が適切に実施されることを確実にするため、最初に計画された入学の>50％での盲検中間分析を独立した第三者によって実施し、潜在的なサ
包含および除外基準
子供は2歳以上の場合、この研究の対象となります。5および8年は、精神障害の診断および統計マニュアル、バージョンファイブ（DSM-5）、および18ヶ月後の症状の発症に記載されている基準に従って、発達小児科医 心理的評価ツールの年齢基準に基づいて2.5年の下限が選択され、思春期に関連する行動変化の交絡効果を避けるために8年の上限が選択されました。 英語での介護者の能力は、（結果評価ツールの性質のために）要件です。 彼らは出生以来の発達遅延を有すると診断された場合、ボランティアは除外されます。
試験の追加の包含基準は、正常範囲内の肝機能（アルブミン34-48g/L）および血清25(OH)D<75+10nmol/L冬に試験に入る場合、<105nmol/L+10nmol/L夏に試験に入る場合。 10nmol/Lの変動は、潜在的なアッセイの変動のために選択されました。 ニュージーランドでは血清25（OH）D濃度が30nmol/Lから44nmol/Lまでの大きな季節変動があるため、除外のために二つの異なるカットオフポイントを適用しています。
調査はニュージーランドのオークランドで行われる。 絶食していない血液サンプルは、ニュージーランドのオークランドにあるノースショアまたはワイタケレ病院で採取されます。 アンケートと人体測定は、ニュージーランドのオークランド、マッセイ大学で行われます。 オークランドはニュージーランド最大の都市で、人口は100万人を超えています。 Asdを持つ約13,000人（32.5％）の個人がオークランド地域に居住していると推定されている。
ステージ1–スクリーニング
スクリーニングと募集（研究のステージ1）は、24ヶ月にわたって行われ、2015年に開始されました。 最初の包含の規準を満たす子供に血の引くことがあり、栄養の不足のために選別されます。 アウトカム測定、試験方法、および入学、介入、および評価のスケジュールについては、それぞれ表1および表2を参照してください。
介入前の準備
ランダム化と試験への参加の前に、ビタミンD、鉄、ビタミンB12の欠乏に対処します。 この試験で適用された栄養不足と管理戦略のリストについては、表3を参照してください。
ステージ2-ビタミンDおよびn-3LCPUFA介入
介入は、一日あたり2000IUのビタミンD3、一日あたり722mgのDHA、2000IUのビタミンD3に加え、一日あたり722mgのDHAまたはプラセボで構成されている。 処置材料はDouglas Nutrition Ltd.によって製造され、供給される引き裂きノズルが付いている750mgゲルのカプセルで渡される。 ニュージーランド-オークランド出身。 調査のカプセル、ビタミンD、n-3LCPUFAsおよび偽薬は出現で同一であり、すべて味がなく、無色である。 子供は、好みの食物に混合した1日4カプセルの内容物を、または注射器による経口投与によって消費する必要がある。 各カプセルの総毎日の取入口そして内容については表4を参照して下さい。 研究期間を通して、子供は自閉症のための任意の治療や薬だけでなく、それはビタミンDやオメガ3が含まれていないことを提供する任意のサプ
2000IUのビタミンD3の補足は幼児の安全な線量であるために示され小児科のフランスの社会は母乳で育てられた幼児の1日あたりの1000から1200IUを 私たちの試験では、2.5〜8歳の体重は乳児よりもかなり大きくなり、有害事象のリスクをさらに減らす必要があります。 さらに、1日あたりの2000IUは、それぞれ1〜3歳および4〜8歳の年齢層についてIOMによって提案された2500および3000IU/日の安全な上限よりも小さい。
722mg/日のDHA用量は、生理学的に関連性があり、食事を通じて達成可能であり（週に約三食分の脂肪魚に相当）、n-3LCPUFAsが行動および学習に及ぼす影響を調査している小児を対象とした他の試験で使用されている用量と同等である。 副作用は600mg DHA/日の線量の子供で報告されませんでした。
無作為化、盲検化、および隠された割り当て
子供は、ASDの年齢と重症度について層別化された四つのグループのいずれかに無作為に割り当てられます。 活性/プラセボカプセルの無作為化、無作為化された配列リスト、およびグループ割り当ては、データ分析を含む研究全体の研究者、子供および介護者から完全に隠蔽される。 研究のいずれの側面にも関与していない第三者は、以下を使用して四と八のブロックでランダムなブロック設計を生成しますRandomization.com (http://www.randomization.com/) 第三者は、介入の適格性が確認され、介護者の同意が得られると、子供に治療コードを割り当てます。 研究ブラインドの破壊が必要となる緊急事態では、主任研究者がランダム化を担当する第三者に連絡して、特定の参加者の治療割り当てを明らかに
データ収集
参加者（介護者および子供）は、マッセイ大学の人間栄養研究ユニット（HNRU）にベースラインと12ヶ月の2回出席します。 ステージ2に募集され、4ヶ月のサプリメントの供給が与えられる前に、介護者は、研究の一次アウトカム対策としてASD（社会コミュニケーション機能と感覚問題）と異常な行動のコア症状に関するいくつかのアンケートを完了し、二次アウトカム対策として胃腸症状に関するアンケートを完了する。 介入が完了すると（12ヶ月）、ASDのコア症状と介護者によって完了した異常な行動のベースライン評価が繰り返されます。 介護者はまた、研究期間にわたって毎週胃腸症状の日記を完了します。
ベースラインでの研究集団の特性を説明するために、さらなる情報が収集されます。 この情報には、食事/食事時間の行動、食べ物の日記、太陽への露出、肌の色、人体測定（体重と身長）が含まれます。 最後の訪問では、食事/食事時間の行動のベースライン評価が繰り返され、子供の体重/身長が測定されます。 結果の測定および試験方法のための表1を参照して下さい。
採血と分析
子供たちは、ベースライン（ステージ1–スクリーニング）、6ヶ月（安全対策）、12ヶ月（エンドポイント）の三つの機会に血液サンプルを採取します。 栄養のbiomarkersおよび試験方法のための表1を参照して下さい。 非絶食された血液サンプルは小児科のスタッフの監督の下で集められ、Wdhbの実験室サービスの北海岸またはWaitakereの病院で処理されます。 栄養のbiomarkersは静脈血のサンプルから試金されます。 これらには、次のものが含まれます: 25(OH)D、RBCの脂肪酸、カルシウム、アルブミン、鉄の調査、ビタミンB12およびfolate、完全な血計算およびビタミンA。rbcの脂肪酸およびビタミンAを除いて、すべてのbiomarkersはNorth Shoreの病院で分析される。 ＲＢＣ脂肪酸は、オーストラリアＮＳＷのＷｏｌｌｏｎｇｏｎ大学で分析され、ｍａｓｓｅｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ａｕａｃｋｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄの研究室でビタミンＡが分析される。
アンケート
主なアウトカム対策は、表1に詳述されているASDのコア症状と共起する問題行動の心理的評価である。 二次的なアウトカム測定は、胃腸の問題の評価である。 HNRUへの訪問中にアンケートを完了する方法について、すべての介護者に標準化された指示が与えられます。 参加者が出発する前に、HNRUの研究者は完全性のためにすべての答えをチェックします。
Social Responsibility Scale™Second Edition(SRS-2):2.5-4.5および4.5–18歳の年齢層に固有のSRS-2バージョンが使用されます。 SRS-2は、Asdに関連する社会的障害を識別し、社会的意識、社会情報処理、相互社会的コミュニケーション、社会不安/回避、およびステレオタイプの行動/制限された利益のドメインにおけるその重症度を定量化します。 SRS-2の臨床的妥当性と感度は、ASDを持つ集団で決定されています。
Sensory Processing Measures™（SPM）：2〜5歳および5〜12歳の年齢層に特化したSPMバージョンが使用されます。 SPMは、感覚処理、計画、アイデア（実践）、および子供の社会参加を評価します。 スケールは社会参加、視野、ヒアリング、接触、ボディ意識（proprioception）、バランスおよび動き（前庭機能）および計画および考え（praxis）を測定する。 この用具はASDの子供で標準化され、認可され、そして使用された。
異常行動チェックリスト（ABC）：ABCは、過敏性、社会的撤退、ステレオタイプの行動、多動、不適切な発言など、さまざまな行動問題を測定します。 それはASDの子供で認可され、ずっとASDの処置の結果の調査で広く利用されています。
胃腸症状アンケート：胃腸症状アンケートは、この研究のために特別に設計されており、ASDの小児で最も一般的に報告されている胃腸徴候および症状を含 研究参加者の介護者は、毎週のオンライン日記を提供され、子供が便秘、下痢、鼓腸、腹痛、嘔吐/吐き気、腹部膨満、原因不明の昼間の過敏性または/および原因不明の夜間の覚醒を経験したかどうか、およびそうであればこれらが何回発生したかを記録するよう求められます。 胃腸症状のアンケートは検証されていませんが、ASD集団で最も広く報告されている胃腸症状、または胃腸症状の結果である可能性のある行動に関する質問が含まれています。 私たちは、自閉症児の胃腸症状を評価するための検証された機器を認識しておらず、確かにニュージーランドではありません。
子供の食事指数（サイコロ）: DICEは、健康な子供や若者のための健康食品と栄養ガイドラインのニュージーランド省に基づいて、研究チームによって開発された簡単な食事品質評価ツー このツールは、2歳から8歳のニュージーランドの健康な子供のコホート（未発表）で検証されており、4日間の推定食品日記と生化学マーカーに対して、この研究でASD
行動小児科給餌評価尺度（BPFAS）: BPFASは、子供の食事時間の行動と両親の態度や行動を測定する簡単な評価ツールです。 これは、子供の行動についての25-likertスケール（5ポイント）の質問と親の態度や行動についての10の二分法の質問からなる35項目のスケールのアンケートです。 ＢＰＦＡＳのカットオフスコアは最近確立されている。 BPFASはよい内部妥当性およびテスト再テストの信頼性の最も信頼できる親管理された供給のアンケート、である。
四日目推定食日記: 食事摂取量データは、週末の一日を含む4日間の推定食品日記によって収集されます。 正確に食品日記を完了する方法についての指示は、食品日記が提供されます。 参加者には、小冊子の返却のための無料ポスト、事前に宛名された封筒が与えられます。 平均マクロおよび微量栄養素摂取量は、Ｆｏｏｄ Ｗｏｒｋｓ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ７（Ｘｒｙｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｂｒｉｓｂａｎｅ，ＱＬＤ，Ａｕｓｔｒｉａ，２ ０ １ ２）を用いて報告された４日間にわたって評価される。
本研究では、回答者の負担が高く、7日間の食事日記などの長い食事日記の時間のかかる特性のために、4日間の食事日記を選択しました。 栄養摂取量の人内変動が高いため、摂取量を非常に正確に推定するために、より長い期間にわたって食事摂取量を記録することが推奨されます。 しかし、4日間の食事日記が異なる日をランダムにカバーする場合、食事摂取量の正確な推定値を提供することができます。
太陽への曝露、肌の色、栄養補助食品、およびそれに続く特別な食事療法に関する情報は、現在の研究の目的のために特別に設計されたアンケートによ 太陽への露出アンケートには、太陽への露出に対する介護者の信念と態度に関する質問だけでなく、妊娠中の居住国と都市、出生の季節、温度と光の極端
投薬への準拠/研究プロトコルへの遵守
介護者は、オンラインコンプライアンスと胃腸問題日記へのリンクと自閉症と栄養問題に関するヒント/事実を含む毎週の電子メールを受信します。 介護者は、士気の目的のために、コンプライアンスを奨励するために、1月、3月、6月、9月に電話で連絡されます。 介護者はまた四半期ごとの試験の時事通信を受け取る。 ニュースレターには、研究の更新、ASDに関する一般的なトピック、そのトピックに関連した介護者の経験、および研究の子供のための娯楽/競技が含まれます。
新しい介入材料は4ヶ月ごとに参加者に送付され、介護者は前の月からのボトルを脇に置き、未使用のカプセルを入れて、次回の訪問（6または12ヶ月） 治療への準拠は、介入が完了したら、各参加者の残りのサプリメントを数えることによって分析されます。
有害事象
すべての参加者は、6ヶ月後に血液検査のために回収され、高ビタミンd（血清25(OH)D>225nmol/L）および高カルシウム血症（血清Ca>2.7mmol/L） 結果は、盲検ではない（ただし、結果の分析には関与していない）第三者によってチェックされます。 第三者は血液検査の結果を識別し、子供の血清25（OH）Dまたはカルシウムレベルが安全な上限の上にあれば検討および推薦のための試験の小児科医 ２ ５（Ｏ Ｈ）Ｄ濃度が２ ２ ５ｎｍｏｌ／Ｌにあるか、または２ ２ ５ｎｍｏｌ／Ｌに近づいている場合、または高カルシウム血症が存在する場合、用量投与は調整されるであろう。
コンプライアンスと胃腸症状の日記は毎週監視され、すべての副作用は有害事象ログに記録され、子供の一般的な健康と行動反応を追跡します。 有害事象の場合、子供の健康は3〜4週間連続してより密接に監視され、有害事象が持続する場合は、報告書はさらなる調査のために試験小児科医および上級調査官に参照されます。
結果の発信
食品日記の受領と分析、およびスクリーニング時の生化学的アッセイの完了後、各参加者にフィードバックフォームが届きます。 人体測定および血液結果（鉄試験、ビタミンB12、葉酸および全血球数）も含まれます。 試験への募集が完了すると、試験に進んでいない参加者は、ビタミンDおよびRBC脂肪酸レベルの通知を受け取ります。
試験が完了すると、参加者はベースラインと終了ビタミンDおよびRBC脂肪酸の状態、および有効用量またはプラセボ用量のどちらを服用していた 彼らはまた、SRS-2とSPMの心理的評価結果の要約を受け取るでしょう。
参加者およびその他の利害関係者（医療従事者、地区保健委員会、一次保健機関、ASD支援グループなど）には、研究の調査結果へのアクセスが与えられます。 結果は、国内外の科学会議で発表され、査読された雑誌に掲載されるように準備され、メディアに配布されます。
データ処理と統計分析
名前と住所の詳細はMicrosoft Excelで維持されます。 チェックボックスには、研究を通じて参加者の進捗状況が記録されます。 他のすべてのデータは、参加者が一意の件名番号によってのみ識別される単一のMicrosoft Excelスプレッドシートに入力されます。 アンケートの採点は、心理学者と研究者によってダブルチェックされます。 すべてのエントリは、研究チームの別のメンバーによってダブルチェックされます。 すべての文書は機密の条件の下で安全に貯えられ、5年間アーカイブされます。
統計分析は、IBM SPSSバージョン21.0(IBM Corp;release2012. IBM SPSS Statistics for Windowsバージョン21.0。 アーモンク、ニューヨーク、米国）。 統計分析を開始する前に、データはクリーニングされ、コーディングエラーがないかチェックされます。 データは、ランダムに正確性と完全性をチェックし、ソースデータに対して検証することによって妥当性がチェックされます。 変数は、Kolmogorov-Smirnov検定、Shapiro-Wilk検定、および正規性プロットを使用して正規性を検定します。 非正規分布データは、対数変換によって近似正規分布に変換されます。 データは、正規分布データの平均（標準偏差）として適切に報告されます; 変換されたデータは、要約統計から幾何平均（95％CI）に逆変換され、非正規分布データは中央値（25番目、75番目の百分位数）として記述され、カテゴリデータは頻度とし
参加者のベースライン特性は、パラメトリックデータの分散分析（ANOVA）とノンパラメトリックデータのKruskal-Wallis検定を使用してグループ間で比較されます。 自閉症の症状に対する治療の効果を12ヶ月にわたって比較する一次分析は、一般化された線形混合モデルの手順を使用して実施される。 処置および時間は固定効果として含まれ、介在と時間間の相互作用はテストされます。 有意な主効果または相互作用効果が観察された場合、Bonferroni調整による事後分析が実行される。 潜在的な交絡因子および効果修飾因子（例えば、ベースライン２ ５（Ｏ Ｈ）ＤおよびＲＢＣ脂肪酸、ベースラインにおける自閉症の症状、年齢および性別）をモデル内で調 ロジスティック回帰は、乗法的相互作用をテストするために使用されます。 Adiditivityの下の単一性と等しく、反対を提案するとき単一性よりより少しであるRothmanの共同作用の索引はASDの中心の徴候のビタミンDおよびオメガ3LCPUFAsの仮定された相互作用の効果を調べるのに利用される。
12ヶ月間の胃腸症状に対する治療の効果を比較する二次分析は、同じ手順を用いて実施される。 潜在的な交絡因子および効果修飾因子（例えば、胃腸症状のベースライン診断および薬物/サプリメントの使用）をモデル内で調査する。
試験を完了し、試験から撤退した参加者の違いは、独立したt検定または連続変数（年齢など）のマン–ホイットニー検定とカテゴリ変数（性別など）のカイ二乗を用いて分析される。
ベースラインにおけるASD症状の重症度と栄養状態（具体的にはビタミンD、RBC脂肪酸、鉄、ビタミンB12）との関連性を回帰分析を用いて評価する。 情報は、ASDの重症度との有意な関係を示す栄養状態のtertilesに従って治療応答を評価するために使用されます。
intention-to-treatとper-protocolの両方の分析が利用されますが、主な分析方法はintention-to-treatです。 統計的有意性は、有意であると考えられるP<0.05を伴う両側検定に基づいている。
