この投稿は、UCSFのNikon Imaging CenterのKurt Thornによって寄稿されました。
生細胞イメージング実験の一般的な要件は、複数の蛍光標識された種を同時に追跡する能力である。 蛍光タンパク質標識でこれを行うには、その励起と発光スペクトルが顕微鏡上の別個の蛍光チャネルで撮像されるのに十分に異なる複数の蛍光タン 近年の蛍光タンパク質の増殖に伴い、一緒に画像化することができる多くの蛍光タンパク質の組み合わせがあるが、これはまた、蛍光タンパク質の選択にはいくつかの考えが必要であることを意味する。
マルチカラーイメージング実験で蛍光タンパク質を選択する最初のステップは、どの蛍光タンパク質が利用可能であるかを認識することです。 新しい蛍光タンパク質が毎月公開されているため、特定のアプリケーションに最適なタンパク質を決定することは課題です。 最新の蛍光タンパク質に遅れないようにするために、私は現在利用可能な最高の蛍光タンパク質のインタラクティブなグラフと表を維持します。
互換性のある蛍光タンパク質の選択
一緒にイメージングする蛍光タンパク質のセットを選択するには、個々の蛍光タンパク質を選択するときと同じ要因（明るさ、光安定性など、これらの要因の詳細については、以前のブログ記事を参照してください）を考慮する必要があります。 さらに、互いに区別することができ、あなたが使用するように意図する顕微鏡の光学とイメージすることができる蛍光蛋白質を選ぶ必要があります。 二つの蛍光タンパク質が互いに分離できるかどうかの正確な決定は、それらの励起と発光スペクトルの知識を必要とするが、経験則は、二つのタンパク質のピーク励起波長とピーク発光波長の両方が50-60nmで分離されるべきであるということである。 例えば、ＣＦＰ（ｅｘ４ ３ ０ｎｍ／ｅｍ４ ７ ４ｎｍ）およびＹＦＰ（ｅｘ５ １ ４ｎｍ／ｅｍ５ ２ ７ｎｍ）を一緒に撮像することができるが、ＣＦＰおよびＧＦＰ（ｅｘ４ ８ ８ｎｍ／ｅｍ５ ０ ７ｎｍ）は、２つの蛍光タンパク質間のいくらかのクロストーク スペクトルが重複する蛍光タンパク質を画像化する必要がある場合は、蛍光タンパク質を分離するために使用できるスペクトル非混合のような技術がありますが、これらはこの記事の範囲を超えています。
あなたの蛍光タンパク質はあなたの顕微鏡光学系と互換性がありますか？
興味のある蛍光タンパク質が顕微鏡光学系と互換性があるかどうかを判断するには、タンパク質の励起スペクトルと発光スペクトルを顕微鏡上のフ 理想的には、タンパク質が顕微鏡によって十分に励起され、タンパク質の蛍光放出が顕微鏡によって効率的に収集されるように、励起フィルタと 蛍光タンパク質とフィルターセットの間の一致を比較するために、多くのフィルターセットベンダーは、タンパク質と染料とそのフィルターの蛍光スペク これらは一般的に使用されているすべての蛍光タンパク質を含んでいるわけではありませんが（特に最近公開されたものではありません）、良い出発 多くの場合、関心のあるタンパク質が同様のスペクトルを持っていることがわかっている場合は、密接に関連するタンパク質のスペクトルを使用 たとえば、標準のCy3またはRhodamineフィルターセット（Chroma＃49004）をmCherryとTagRFPの両方のスペクトルと比較したChroma Spectra Viewerのスクリーンショットを次に示します。
ここで、TagRFPスペクトルは暗い色で示され、mCherryスペクトルは明るい色で示され、励起スペクトルは青色であり、発光スペクトルは赤色である。 どちらもフィルタセットと完全に一致しないが，励起フィルタはＴａｇｒｆｐ励起のピークの多くを励起し，発光フィルタはｍｃｈｅｒｒｙ発光よりもＴａｇｒｆｐ発光の大きな割合を収集する。 このフィルタセットでは、TagRFPがmCherryよりも明るい信号を与えることが期待されます。 一般に、Rhodamine/Cy3のために設計されているフィルターセットはtagrfpまたはmruby2のような短波長の赤い蛍光蛋白質とmCherryのような長波長蛋白質よりよく働く。 蛍光およびフィルターセットの背景については、iBiologyの蛍光顕微鏡入門講義を参照してください。
一般的に使用されるフィルターセット&関連する蛍光タンパク質
多色イメージングのために一般的に使用されるフィルターセットには、CFP、YFP、RFP用に設計された405 / 488 / 561 / 640 nm）。 私たちの手では、このセットでイメージングするための最良の蛍光タンパク質は、mtagbfp2、EGFPまたは改良されたGFP変異体の一つ、mruby2またはTagRFP-T、およびifp1.4 これらの赤外線蛍光タンパク質は補因子としてbiliverdinを必要とするので、最大の明るさのためにbiliverdinで細胞を補う必要があるかもしれないことに注意し 哺乳類細胞では、mEmeraldやCloverのようなEGFPの改良された折り畳み変異体の一つがおそらく最良であり、mNeonGreenは非常に明るいと考えられているさらに新しい緑色 Sでは、 cerevisiae、我々はこのフィルターセットで緑と赤の蛍光タンパク質の数をテストし、明るさの測定を報告しています。 ここでは、EGFPは、おそらく低い成長温度のために、改善された折り畳み変異体よりも優れています。 しかし、これはまた、すべての生物に最適な単一の蛍光タンパク質が存在せず、最も明るい信号が必要な場合は、関心のあるシステムでいくつかのタン 最後に、タンパク質のこのセットでは、緑と赤のタンパク質は、一般的に最も検出可能であるので、より豊富なタンパク質やマーキング区画に使用される青と赤外線チャネルで、あなたの最も豊富なタンパク質をタグ付けするために使用する必要があります。
これが蛍光タンパク質を用いた多色イメージングに光を当てることを願っています。 適切な顕微鏡と蛍光タンパク質の適切な選択により、四色を同時にイメージングすることは非常に簡単でなければなりません。
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Kurt ThornはUCSFの准教授であり、Nikon Imaging Centerを指揮しています。 UCSFでronald Valeの研究室で生物物理学の博士号を取得した後、ハーバード大学バウアー・ゲノミクス研究センターの研究員を務めました。 彼の研究室のwebページまたは彼の顕微鏡のブログで詳細をご覧ください。
