蛍光色素による多色染色は、組織および細胞研究の分野で生物学的材料(タンパク質、脂質、核酸、イオンなど)の分布を観察するために積極的に使用されている。 蛍光観察のための検出技術は、最良の状況下で単一の蛍光色素分子を検出することができるレベルまで進歩しています。 このセクションでは、新しい蛍光顕微鏡技術である蛍光寿命イメージング顕微鏡（FLIM）の重要な側面のいくつかをレビューします。 多色染色に加えて、蛍光寿命イメージングを利用して、色素分子の蛍光寿命特性、すなわち分子周囲の環境の状態に影響を与える要因を視覚化するこ
波長分光法
従来の蛍光顕微鏡では、蛍光色素の色特性を利用しています。 この技術を用いると、紫外線から近赤外までの波長範囲の5つか6つの染料は色間の混乱無しで顕微鏡検査の下で同時に使用することができます。
寿命分光法
各蛍光色素は励起状態で独自の寿命を持っています。 寿命の違いを検出することにより、同じ蛍光色を有する染料であっても識別することができ、自家蛍光を識別することができる。 さらに、通常使用される蛍光色素と比較して非常に長い寿命を有するプローブを使用することにより、高い信号対雑音画像を得ることができる。 例えば、白金コプロポルフィリンはミリ秒オーダーの寿命を有するが、通常の蛍光色素の寿命はナノ秒オーダーである。 このような比較的長寿命の蛍光色素は、すぐにチップ上のDNA検出のためのプローブとして使用される。
蛍光寿命イメージングにより、生きた細胞を観察しながら分子に関する情報を得ることも可能になります。 蛍光寿命に影響する因子は，イオン強度，疎水性，酸素濃度，分子結合，二つの蛋白質が互いに接近したときのエネルギー移動による分子相互作用などである。 しかし、寿命は、色素濃度、光退色、光散乱および励起光強度とは無関係である。 したがって、蛍光寿命イメージングは、正確なイオン濃度測定と蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）分析を行うことができます。
蛍光寿命イメージングには、時間領域法と周波数領域法の二つの方法があります。
- 時間領域FLIM-パルスレーザーによる励起後の遅延の場合には、イメージインテンシファイアのゲート操作によって蛍光画像を得ることができます。 励起状態の寿命は通常1-20ナノ秒であるため、寿命は数百ピコ秒のパルス持続時間とナノ秒レベルのシャッターを持つレーザーによってナノ秒単位で測定される。 Ｈｉｇｈ−ｓｐｅｅｄ ｇａｔｅ ｉｍａｇｅ ｉｎｔｉｅｎｔｉｆｉｅｒは、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｋ． 各画素における蛍光寿命は、ゲートが開くまでの遅延時間を変化させながら測定することによっても得ることができる。 蛍光寿命画像は、その寿命に応じて擬似色で示されている。
- 周波数領域FLIM-蛍光寿命は、励起光源として使用するレーザーを変調したときのゲイン変調器を備えた検出器を用いて、蛍光の位相シフトとその振幅の減少を測定することによって計算される（1-200メガヘルツ）。 測定は、レーザー走査（光電子増倍器）または電荷結合素子（ＣＣＤ）を使用して行うことができる。
用途
蛍光寿命が水素イオン濃度（pH）、酸素、カルシウムイオン濃度に敏感であるという事実に基づいて、プローブを取り巻く環境を検出します。 分子間の結合または相互作用は、ＦＲＥＴと組み合わせて測定することもできる。
カルシウムイオン濃度イメージング
カルシウムイオンがFura-2、Fluo-3、Calcium Greenなどの蛍光プローブに結合すると、蛍光寿命と蛍光強度の両方が変化します。 イオン濃度測定のための従来の手順は、強度の変化に焦点を当てています。 カルシウムイオン濃度の変化に応じて、結合したカルシウムイオンと非結合したカルシウムイオンとの間の色素の比率が変化し、これはその後、試料中の測定スポットの蛍光寿命の変化をもたらす。 カルシウムイオンプローブに加えて，この技術はナトリウムイオンやマグネシウムイオンなどのｐ ｈおよび他のイオンの測定にも適用可能である。＜4865＞＜7027＞蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）＜4865＞＜7027＞現在、緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）変異体（蛍光色の異なるＧＦＰ）によるＦＲＥＴの研究が行われている。 ＦＲＥＴは、一対の蛍光色素で標識された２つのタンパク質間の相互作用（会合または解離）を測定することを可能にする。 ドナー蛍光色素は、アクセプター蛍光色素にエネルギーを提供するより短い励起／発光波長を有する。 ドナー色素の励起状態の寿命は、アクセプター（エネルギーを受け取る色素）が存在するかどうかによって変化する。 寿命に基づく測定は検出の間に蛍光性の重複を考慮することは必要ではないのでよりよい定量化を可能にする。
クリニカルイメージング
一部の組織および細胞診標本は強い自家蛍光を有するため、長寿命（最大ミリ秒）のプローブの使用が試みられています。 同時に使用することができる色の数がこの技術と限られているので長い寿命の調査は蛍光性のin situのハイブリダイゼーション（FISH）にまた有用である。 血液中の水素イオン濃度、酸素および二酸化炭素圧力は、蛍光寿命に基づいて既に測定されているが、このような測定は顕微鏡下ではまだ不可能である。
インターネットリソース
- 蛍光分光センター-ジョセフ-R教授が主催。 Lakowiczメリーランド大学では、このウェブサイトは、蛍光寿命イメージングと蛍光分光と顕微鏡の他の側面についての情報のための優れたリソースです。
- Kentech Instruments-kentechは、蛍光寿命イメージングのための高電圧固体パルス発生器および光ゲートイメージングシステムを製造しています。
- 浜松ホトニクス-デジタルカメラシステムの優れたラインナップに加えて、光電子増倍管、アバランシェフォトダイオード、高速ゲートイメージインテンシファイアも製造しています。
- PRS BioSciences-生体蛍光顕微鏡に特化したPRS BioSciencesは、多くの研究顕微鏡に適応できるアフターマーケットタイムゲートシステムを製造しています。
