Mito核内introgressionラインの構築
核ゲノムからmtDNAの遺伝的影響を単離するために、我々の実験はmit核内introgressionライン（MNILs）に基づいていた。 Ｍｎｉｌｓの構築はＫｕｒｂａｌｉｊａｎｏｖｉｃｉｃらに詳細に説明されている。 . 簡単に言えば、使用されたすべてのMnilは、共通の単一の自然集団（Sicevo Gorge-Serbia、S43°19’55.58″N22°0837.98″）に由来する単一の野生収集された交配雌によって設立されたisofemale line（IFLs）から作成された。 ライン第genotypedそのmtDNAハプロタイプを制限酵素として採択したIFLsのたこんにちはハプロタイプ、斐伊ハプロタイプ、それぞれそのbackcrossed共通七IFL(“D”) 各MNILでは、バッククロスは、Dラインから20男性と与えられたIFLから10処女女性をペアリングすることによって行われました。 我々は、一般的な近交系D核ゲノム（>99.95％置換）と与えられたIFLの核ゲノムを置き換えるために12次の世代のためにこの繰り返し内因性バッククロス IFLsは同系交配されていないか、そうでなければ等原性になっていないことに注意してください。 導入中の汚染の可能性を排除するために、すべてのMnilのmtDNAの整合性は、各MNILからのハエのサンプルをジェノタイピングすることにより、世代5、8および12 我々はまた、García-Martínezらに詳述された方法を使用して16S rDNA Wolbachia特異的プライマーを使用してPCRアッセイによって、すべてのMNILsにおけるWolbachiaの存在をスクリーニングした。 . 陽性対照として、Ｗｏｌｂａｃｈｉａを含有する２つの異なるショウジョウバエ株を使用した（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ｓｔｏｃｋ ｎｏ．５，Ｂｌｕｍｉｎｇｔｏｎ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｄ．ｓｉｍｕｌａｎｓ，Ｒｉｖｅｒｓｅ ｄｒａｉｎｓ）。 これらのＰＣＲアッセイは，Ｄ系統と同様にＭｎｉｌｓの全てに対して陰性であった。 全てのラインを維持し、全ての実験は、一定の実験室条件下、１ ９℃、６ ０％相対湿度、３ ０ ０ｌ ｘの光、および１ ２時間の光周期：１ ２時間の暗さで行った。
実験進化集団の創設
実験に先立ち、HIを運ぶ三つのMNILsを一つのHI源集団に、三つのHII MNILsをHII源集団に統合し、MNILs全体の潜在的な核遺伝的変異を均質化した。
実験進化集団の創設
こんにちは、こんにちは、HIを持つ三つのMNILsをhii源集団に統合した。 これは、各MNILから100匹の成体ハエを二つの集団ケージ（すなわち）に混合することによって行われた。 ケージあたり3×100ハエ）（プレキシグラスケージ、L25cm x W15cm xh15cm、それぞれ30mlのコーンミールを含む3皿）および標準的な実験室条件下でこれらを1回の後の完全な世代のために維持する。 二つのソースの集団が、いずれかのこんにちはの斐伊mtDNAハプロタイプで表した、outbred、共通核の遺伝的背景（D）。 これら二つのソース集団から処女ハエは、その後、セックスし、実験的な進化集団を発見するために使用されました。
私たちはN=12の実験的進化集団を開始しました。 各集団において、３〜５日齢のＮ＝１ ０ ０羽の処女ハエ（性比１：１）を、供給源集団から集団ケージ（Ｌ２ ５ｃｍ ｘ Ｗ１ ５ｃｍ ｘ Ｈ１ ５ｃｍ）に導入した。 我々は、以下の方法で、2×2交差デザイン（細胞あたりN=3集団）を使用して、集団全体でHIおよびHIIハプロタイプと食品資源条件の開始頻度を変化させた。。こんここんにちは、以下のようにして、 半分のケージ、80%の創業は飛んでしたからこんにちはソース人口の20%から斐伊源。 その他、20%の創業は飛んでしたからこんにちはソースの人口の80%から斐伊源。 食品資源条件に関しては，培地の量（体積および表面積の両方）は二つの処理群で同一であったが，栄養濃度の集団変動内では以下のように操作した。 ケージの半分（均質な食品条件）は、3つの同一の食品皿を含み、それぞれ30mlの標準コーンミール培地（YC）が1.5％の酵母を含む。 ケージ（異種食品条件）の残りの半分はまた、3mlの標準培地でそれぞれ30皿を含んでいたが、これらは酵母濃度（YL-0.375％、YC-1.5％、YH-6％）が異なっていた。
実験進化個体群の維持
個体群は、40日/サイクル、19℃、相対湿度60％、12時間の光：12時間の暗周期で離散世代を確保する方法で実験室で維持されました。 40日目には、三つの古い食べ物の料理が三つの新しいものに置き換えられ、ハエは産卵のために合計9日間で許可されました。 卵と幼虫を含む新しい料理は、その後、任意の大人からクリアされ、次の世代を開始するために新しいケージに転送されました。 彼らは死んでいた後、それぞれの古いケージ内のすべての大人のハエは、その後、カウントされました。
配列決定とマイトゲノームアセンブリ
ハプロタイプ頻度推定（下記参照）の前に、使用されるすべてのmtDNAハプロタイプを配列決定し、組み立てました。 DNAを抽出したものがライン(こんにちは:1,3,5;斐伊:21日、25日、29日)を作成するのに使用されMNILs、塩-エタノールの降水プロトコルです。 ハエを最初に穏やかに浸軟させ、プロテイナーゼKと共に調製緩衝液（100mM NaCl、10mM Tris-HCl、pH=8.0、0.5％SDS）に入れ、ボルテックスし、50℃で一晩インキュベートした。 その後、試料を一晩凍結した。 ＤＮＡを沈殿させるために、９ ５％エタノールを添加する前に飽和Ｎａｃｌを数回添加し、ＤＮＡをペレットに紡糸した。 ＤＮＡペレットをＴＥ４緩衝液中に懸濁した（ｐＨ＝７． DNAの質および量はnanodrop、QubitおよびBioanalyzerを使用して査定され、agaroseのゲルの片の長さの査定に先行していました。
配列決定ライブラリは、TruSeq PCRfree DNA library preparation kitを用いて100ng DNAから調製した。 次いで、６つの試料を、ｖ４配列決定化学を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈ Ｉｓｅｑ２ ５ ０ ０システム上の２レーンで１ ２ ５ｂｐ対端読み取りに配列決定した。 合計で、各ライブラリの平均194百万の読み取りをシーケンスしました。 その後、各ライブラリからの読み取りの総数の5％のサブセットを使用して、六つのサンプルからのマイトゲノームを組み立てました。 読み取りはMITObim V1.8アルゴリズムとMIRA v4.0に供給されました。2アセンブラは、ガイドされたアセンブリを行うために、ショウジョウバエpseudoobscura mitogenome(GenBank:FJ899745.1)を参照ゲノムとして用いた。 得られたすべてのアセンブリは、ほぼ16kbpのサイズを持つ円形のマイトゲノームであった。 次いで、最終組立体を、ＣｌｕｓｔａｌｗおよびＭＡＦＦＴを使用して整列させ、各ハプロタイプの最終研磨された組立体を得るために手動でキュレーションした。 組み立てられたmitogenomesは、デフォルトのパラメータ設定を使用して、ドグマとMITOSを使用して注釈を付け、最終的に手動でキュレーションしました。
私たちのマイトゲノームアセンブリの妥当性を評価するために、GenBank上で利用可能なすべてのショウジョウバエsubobscura mtDNA配列（Cox1、Cox2、Cox3、Cob、Nad1、Nad2、Nad3、Nad5、rrnL、rrnS、A+Tリッチ 例外なく、これらは、＜３ ５ ８ １＞９ ９％の配列同一性を示した。
数独自のSnpが見つかり、mitogenomeハプロタイプ(下記参照)は、二一貫して抜群のこんにちは斐ハプロタイプです。 各SNPのカバレッジ深さは、Bowtie v1.2を使用してマイトゲノムアセンブリに使用される読み取りをマッピングすることによって検証されました。 これらの努力により、組立工程で同定されたすべてのＳｎｐが確認された。 ここでは、集団間で集団内多型の顕著かつ一貫したパターンを示す二つの主要なハプロタイプグループIとIIに焦点を当てています（図。 1）および機能表現型の違い（はじめに参照）。 Ｓｎｐは、２つのハプロタイプ群のそれぞれ内で発生するが、そのようなＳｎｐは稀であり（例えば）、一貫して多型ではない。
mtDNAハプロタイプ頻度の推定
我々は、各実験進化集団の第5世代と第10世代からハエのサンプルを配列決定することにより、ハプロタイプ頻度の進化を推定するためにpool-seqを使用しました。 各試料において、ケージあたり１ ０ ５個の無作為に選択されたハエをプールし、ＤＮＡ抽出（１ ５の群で）および上記のような配列決定ライブラリー調製物に供した。 次いで、ｎ＝２ ４サンプルを、ｖ４配列化学を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈ Ｉｓｅｑ２ ５ ０ ０システム上の２レーンで１ ２ ５ｂｐ対端読み取りに配列決定した。 私たちのプールseqの努力は、mtDNAハプロタイプ頻度の正確な推定のための十分な配列決定の深さを提供するために設計されたが、核ゲノムの詳細な分析を
私たちは、平均して、各ライブラリのために66百万の読み取りをシーケンスしました。 各ライブラリからの読み取りは、Bowtie v1.2を使用して唯一のユニークでゼロミスマッチマッピングを保持し、六つの組み立てられたマイトゲノームにマッ の数を読み込みマッピングのSNPsとのこんにちは斐種類（Nad5と12S rRNA)を対象として使用を想定し、相対的に周波数の主なハプロタイプ(こんにちはや斐伊各サンプルです。
統計分析
各サンプルについて、2つの診断Snp（下記参照）にマッピングされたすべての読み取りは、タイプHIまたはタイプHIIのいずれかであるとカこんにちこんにちはカウントされました。 二つの異なるSnpのHI読み取りの割合は、両方のマーカーが事実上同一の推定値を提供するように、24のサンプル（r=0.987）にわたって実際に非常に密接に相関していた。。こんにちは、2つの異なるSnpの読み取りの割合が非常に密接に相関していた。 ここで使用しました平均割合が設けられていないこのSnpの頻度こんにちは各プールの配列番号サンプルです。
進化は、集団内の遺伝子型頻度の変化として定義することができ、我々の設計は、Δ F0–5=(f5–f0)/5またはΔ F5–10=(f10–f5)/5のいずれかとして、私たちの各進化ラインにおける世代ごとのハプロタイプ頻度の変化の二つの時間的に分離された反復測定を導出することができた。 さらに、正味のハプロタイプ頻度変化を評価するために、Δ Ｆ０−１ ０＝（ｆ１ ０−ｆ０）／１ ０を推定した。 が二つの遺伝子型に与える周波数のこんにちは:fI=1–収容した施設は、このように制限する弊社の分析の変化の周波数のハプロタイプ. Δ Ｆの各推定値について、我々はまた、ハプロタイプ頻度の観測された変化を引き起こすために必要な選択の強さに対応する周波数依存選択係数（Ｓ ｉ）を導出した（
それぞれの進化する線は、私たちの設計における観測単位を表しているため、反復測定ANOVAs（すなわち、被験者内ANOVAs）を使用してデータを分析しました。 ここでは、各アインシュタインの件名、開始周波数のこんにちは(0.2 0.8)環境条件均一または異なった二間-科目要素の繰り返し施策の定またはSI）では、異なる世代間隔になっており内科要因です。 これらの解析では，被験者間の焦点因子は実験処理の効果をテストし，被験者内因子は実験の過程で進化のパターンが変化したかどうかをテストした。 この解析戦略は，複製された独立した線における周波数ダイナミクスを追跡し，ｍｔｄｎａダイナミクスにとって実質的であると予測されるランダム遺伝ドリフトの非焦点効果が推論モデルの残差項の一部を形成するという事実に基づいている。 被験者間因子の従来のF検定は、データの9999ランダム順列に基づいて、順列検定を使用して検証されました。 異なるグループの平均SIは、データの9999ブートストラップ複製から95％CIを使用して評価しました。
見積りの強度の周波数依存性の選択
またより明示的に評価するか否かの強度の周波数依存性のものを選択すこんにちは斐違全体の環境実験的治療(均質/異種). これを可能にするために，以下の理論的根拠を用いて経験的データから周波数依存選択の簡単な尺度を導出した。 このシステムにおける非実験データの以前の明示的なモデリングは、これらのmtDNAハプロタイプに正または負の選択がないが、両方のハプロタイプに同 を考える二つのmtDNAハプロタイプこんにちは斐の周波数pI個人情報(pI+個人情報=1)fitnesses WIとなる。 PIの世代ごとの変化は、次のように与えられます
$$ \デルタ{p}_I=\frac{p_i{p}_{II}\left（{W}_I-{W}_{II}\right）}{\overline{W}_{II}\Right）}{\overline{W}_{II}}Deltaは、Delta W DeltaとDelta W pの両方を意味します。}} $$
両方の自然集団からの観察（図を参照）。 1追加のファイルの1)のデータを研究所ケージ集団のことが選択の左右対称性と均衡のためのハプロタイプこんにちは斐周辺のpI=個人情報=±0.5℃です。 （Ｉ）ｐｉ＝ｐｉｉ＝０の平衡周波数を仮定する。図5に示すように、(ii)ハプロタイプ適合度がハプロタイプ頻度に線形に関連していること、および(iii)選択が対称であることは、以前の研究によって支持されているすべてであることを達成する。
$$ {W}_I=1-{p}_I{s}_I$$
$$ {W}_{II}=1-{p}_{II}{s}_I$$
ここで、sIは周波数依存選択係数です。 したがって、Δ p_{I}=p_{I}+p_{II}=P_{I}+p_{II}=p_{I}+p_{II}=p_{I}+p_{II}=p_{I}Wである。
$$ {frac P_I=\Frac{1}{2}+\Frac{1}{2}+\Frac{1}{2}+\Frac{1}{2}+\Frac{1}{2}+\Frac{1}{2}+\Frac{1}{2}+\Frac{1}{2}+\Frac{1}{2}+\Frac{1}{2}+\Frac{1}{2}+\Frac{1}{2}+\Frac{1}{2}+\Frac{1}{2}+\Frac{1}{2}+\Frac{1}{2}+\Frac{1}{2}+\Frac{1}{2}+\Frac{1}{2}+\Frac{1}{2}+\Frac{1}{2}+\}^2} $$
このように定義すると、sIは任意のスケールを仮定しますが、Δ Piがアトラクタに向かって変化すると正になり、アトラクタから離れると負になります。 各ケージについて、我々はそれぞれ、世代0-5と5-10の間で観察されたハプロタイプ頻度の変化に基づいてsIの二つの独立した繰り返し測定を推定した。 我々は、真の平衡がpI=pII=0.5に近いときに我々の尺度が正確であるが、真の平衡がこの条件から逸脱する場合にはより近似的であることに注意する。
