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CPV-2は、イヌのウイルス性胃腸炎の主な病因である。 パルボウイルス科（パルボウイルスか、Parvoviridae）は、プロトパルボウイルス属およびプロトパルボウイルス1型に分類されるウイルスの1種である。 これは、一本鎖DNAゲノムを有する非エンベロープウイルスであり、ウイルスゲノムの組み立ておよびパッケージングに必要な二つのカプシドタンパク質、VP1およびVP2、ならびにDNA複製、組み立ておよび遺伝子発現の調節を制御するNS1およびNS2非構造タンパク質をコードする。

過去数年間にわたり、CPV-2は新しい抗原変異体を開発してきました。 1980年に、CPV-2元の株はタイプ2a（CPV-2a）と指定された変異体に置き換えられ、1984年にCPV-2bが同定され、2001年にCPV-2cが検出され、イタリアで報告された。 最後の変種も同定されているアジア、アフリカ、アメリカで。 CPV-2のための多数の抗原の変形の存在が原因で、臨床印はgreathly変わることができます。その後、獣医師は事前診断を発行する際に確実性が低く、通常、診断を確認するためにいくつかの実験室試験が必要です; 赤血球凝集アッセイ、免疫蛍光、ELISA、PCR、イムノクロマトグラフィ検査、細胞培養などの研究室ではいくつかの技術が開発されていますが、実際には動物病院の臨床検査室で最も利用可能な技術はイムノクロマトグラフィ検査とPCRですが、これらの手順の感度と特異性に関する研究では、報告は議論の余地があります。さらに、様々な程度の病気の重症度を有する患者では、これらの技術の感度および特異性は広範囲に研究されていない。

本研究の目的は、CPV-2の臨床徴候の多様性を示す患者の診断のためのイムノクロマト検査およびPCRによって提供される利点および欠点を報告す

この研究は、実験動物研究メキシコの公式ノルムNOM-062-ZOO-1999のガイドラインに従って実施されました。

臨床的腸炎を有する犬を、メキシコ国立大学の小動物動物病院に入院させ、この試験についてスクリーニングし、ネストされたPCR（nPCR）を用いてCPV-2の陽性または陰性を試験したことに基づいて選択した。 その結果、陽性と判定された45匹の犬が選択され、陰性と判定された5匹の犬が対照として含まれた。 50匹の犬は、臨床診断の感度を得るために同時に三獣医師によって臨床的に検査されました。 Eachveterinarianは診断用具として問題によって方向づけられる獣医の医療記録(POVMR)を使用して分離した方法の彼の推定診断を、出した。

次に、すべての犬の糞便サンプルをPCRおよびイムノクロマト検査で分析し、血液サンプルを使用して完全な血球数を測定しました。

nPCRは、CPV-2ウイルス粒子を同定するための信頼性が高く敏感な技術であると考えられているため、本研究では、使用された試験の感度は、cpv-2診断のために、nPCRから以前に得られたものと相関していた。

犬の糞便サンプルは、ヌクレアーゼフリー水と200μ lのホモジネートに懸濁した直腸スワブを用いて得られ、dna抽出に使用された。 この手順は、Ｑｉａａｍｐ（登録商標）ＤＮＡスツールＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｍａｉｎｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、製造業者の説明書に従って実施した。 ＡｌｌＤＮＡ試料を、Ｑ５ ０ ０ ０Ｑｕａｗｅｌｌ分光光度計（Ｑｕａｗｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．,サンノゼ,カリフォルニア州,米国). 各サンプルの100ngのDNA50μ lの最終体積でPCR反応に使用された。 以前は、プライマーのペアは、275bpフラグメント、Parvoint2Fb（5′-TCAAGCAGATGGTGATCCAAG-3’）とPARVOINT2Cr（5′-GGTACATTATTTTAATGCAGTTA-3’）VP2遺伝子（GenBankaccession番号）のヌクレオチド1,107–1,130と1,360–1,382に位置する増幅するために私たちの研究室で設計fj0051962c）。＜５ ７ ３ ６＞＜７ ４ ４ ４＞ＰＣＲ反応は、２μ ｌの各プライマー（２ ０ ０ｎＭ）、ＤＮＡポリメラーゼを含有するＧｏｔａｑ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，Ｕ．そして28。5μ lのヌクレアーゼ遊離水。 全ての反応は、以下の増幅条件下で実施した；初期変性のために９ ４℃で１サイクル５分間、続いて９ ４℃で３ ０秒間３ ５サイクル、５ ２℃で１分間、７ ２℃で１分間、およ

nPCRは、最初にParvoext1F(5′-ATGAGTGATGGCAGTTCA-3′)およびParvoext3R(5′-AGGTGCTAGTTGAGATTTTTCATATAC-3′)プライマーを用いて1,740bpの断片を増幅し、イヌパルボウイルスの遺伝子VP2からのヌクレオチド配列1–20および1,712-1,740を用いて設計された（GenBankアクセッション番号fj0051962c）。 反応物を最終体積５ ０μ ｌに標準化した。＜５ ７ ３ ６＞＜７ ４ ４ ４＞反応混合物は、１μ ｌのＧｏｔａｑ（登録商標）Ｆｌｅｘｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ５Ｕ／μ ｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、５μ ｌのＧｏｔａｑ（登録商標）Ｆｌｅｘｉ ｂｕｆｆｅｒ５ＸＧｒｅｅｎ、３μ ｌのＭｇｃｌ２ ２ ５ｍ Ｍ、４μ ｌのＤＮＴＰ２ ０ ０μ Ｍ、２μ ｌのプライマー、１ ０μ ｌのＤＮＡ、１ ０ ０ｎｇの最終濃度 反応は、以下の増幅条件の下で行った：1サイクル94℃で5分間、続いて35サイクル94℃で30秒間、50℃で45秒間、72℃で1分間、および1サイクル72℃で5分間。 その後、この反応の生成物1μ lをネスティング手順のDNAテンプレートとして使用し、プライマーおよび増幅条件は275bp断片について同じであった。

すべての増幅産物は、2％アガロースゲル中の水平電気泳動によって同定された0.5μ g/mlの臭化エチジウムで染色し、UV transilluminatorで可視化した。＜5736＞＜7444＞イヌパルボウイルス（CPV Ag）のイムノクロマト検査の分析には、ANIGEN®kit（Bionote Inc.、韓国京畿道）が利用された。 各testwasは製造業者の指示の後で遂行されました。

血液サンプルは、抗凝固剤としてEDTAを用いたvacutainerチューブを用いて頸静脈から採取した。 完全血球数（ＣＢＣ）は、自動細胞計数器（ＱＢＣ ｖｅｔ−ＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ウェストブルック、私、米国）。 血液膜をＷｒｉｇｈｔ-Ｇｉｅｍｓａで染色し，フォトニックマイクロスコープで調べた。 白血球減少症は、総CBCカウントが6×103/μ l未満であったときに考慮された。

結果エンコードされた変数の行列を使用して分析を行い、分割表を作成して診断テストのプロパティを決定しました。 さらに、Κ統計量は、三つの使用されたテストとnPCRとの間の一致を推定するために決定された。 2015年にKantereらによると、κ値1は絶対的な一致を示し、0の値は偶然によって一致が起こることを示しています。 一般に、0.6より高いカッパ値は良好な一致レベルを示し、分析は統計パッケージSPSS Verを使用して実施された。 22.0(IBM,Inc.、アーモンク、ニューヨーク、米国）。

nPCRによるCPV-2陽性犬の91.1％が純粋飼育された;95。患者の5％は二から八ヶ月の間であり、4.5％は一年より年上であった。 ワクチン接種の状態に関しては、40%はCPV-2伝染を防ぐために少なくとも一度ワクチン接種されました。

これらの犬が示した臨床徴候の頻度は、44.4％が嘔吐および下痢を示し、20％が発熱、嘔吐および下痢（カタル性または出血性）を示し、17.7％が下痢のみを示し、8.8％が嘔吐のみを示し、4.4％が下痢および発熱を示し、4.4％が嘔吐および発熱を示した。白血球減少症は、イヌの48.8％で観察された（表1）。

臨床検査を用いて、獣医師はCPV-2陽性患者の57.8％と陰性犬の100％のみを診断したため、臨床診断の感度値は57.7％（CI0.95 42.2–72）と推定され、観察された特異性は100％（CI0.95 46.2–98.8）であった。

臨床検査診断に関しては、nPCRを通じて陽性となった犬の100％のうち、これらの患者の30/45のみが免疫クロマトグラフ検査を通じてCPV-2陽性であり、CPV-2陰性と診断された。 したがって、この技術は66.6％（CI0.95 50.9–79.5）の感度を示し、観察された特異性は100％（CI0.95 46.2–98.8）であった。

PCR技術を用いて、36/45患者はCPV-2に陽性であり、5人の対照患者はnPCRを通して陰性であることが確認された。 したがって、PCRは、80％の感受性（CI0.95 63.1〜87.7）および100％の特異性（CI0.95 67.8〜99.1）を示した（図10B）。 1).

三つの技術の間の一致は、カッパ値を通じて実証されている（表2）。

CPV-2によって引き起こされる胃腸炎は、犬に影響を与える主なウイルス性疾患の一つと考えられている。 犬のparvovirusの伝染の臨床印が変わるかもしれないが報告されるthemost共通の印は次のとおりだった:食欲不振、不況、無気力、熱、ムコイドおよび出血性の下痢およ

臨床検査中、感染の臨床症状の変動が観察された。 研究された犬のわずか20％が一般的に典型的な徴候を示した文献に記載されている。 この疾患の臨床的変動性は以前に報告されており、いくつかの著者は、年齢、免疫状態、曝露経路、ウイルス量、株の病原性および他の感染性因子との共感染などの要因について考えられる原因として議論してきた。 これは獣医が彼らの臨床検査にもっぱら頼るときCPV-2の正確な診断を得ることを複雑にする。 したがって、この手順のみに基づく調査に関しては、犬の42.2％が偽陰性のCPV-2診断を受けることになります。この研究の犬の医療記録を通して、我々は、主に犬が文献に記載されている古典的な臨床徴候を示さず、CPV-2に対してワクチン接種されたhadbeenおよび/また しかし、私たちの研究の犬のほとんどは非定型徴候を示しました。 したがって、CPV-2の無症状感染がより一般的であり、感度と特異性の高い追加の診断検査を使用するかどうかを決定しなければならない獣医師は、こ

この研究では、CVP-2陽性の患者の40%が以前に免疫されていた。 PCR技術は非常に敏感であることはよく知られており、したがって、最近ワクチン接種された患者の糞便中のバシンウイルス粒子を検出する;研究は、改変された生CPVワクチンによる3日から10日後のワクチン接種から偽陽性の結果を得ることが可能であることを示している。 その結果、実行するためにこの研究では、過去15日にワクチン接種の病歴を有する患者は除外された。 さらに、CPV-2に陽性のワクチン接種された犬からのサンプルは配列決定され、すべての研究されたケースでは、遺伝子変異CPV-2cが同定された（データは示されていない）、これは犬がフィールドCPV-2cに感染していたことを意味し、Cpv-2cvaccineがメキシコではまだ利用可能ではないことを知っていることを意味する。 さらに、メキシコでは、pedrozaらは、感染した犬の最も一般的な抗原変異体がCPV-2cであることを報告した。

一方、多くの獣医師は、cpv-2診断の支持因子である白血球減少症の存在を考慮している。 しかし、我々はそれだけで48を観察しました。調査された犬の8%（22/45）は評価の間に白血球減少症を示しました、犬のおよそ50%が評価の時にhematologicalterationsを表示しないことを示した他のレポートと一致しています。 したがって、CBCは、疾患の重症度に関する情報を提供し、予後を示唆し、治療に対する応答を決定することができる貴重なツールである。 しかし、白血球減少症は、ウイルスの存在の証拠を提供しないため、CPV-2の診断ツールとして考慮すべきではない。

ウイルス同定の様々な技術は、CPV-2による感染の決定的な確認のために使用されており、例えば、イムノクロマトグラフに基づく迅速な試験は、手順が容易で、迅速かつアクセス可能であるため、臨床医によって広く使用されている。 さらに、それは分析のためにspecializedlaboratoryへのサンプル準備か送ることを要求しない。 いくつかの研究では、その感度が50〜100％の範囲であることが示されており、我々の研究では、nPCRとの比較感度は66.6％であった。 ある調査は低い技術の感受性が陽性を得るために犬の腰掛けに取除かれる大きいウイルスの粒子の量の必要性が原因であることをhavesuggested診断。 偽陰性の結果のより高い確率が期待されるので、この技術の使用は再考されなければならない。 これを防ぐためには、より高い感度を有するさらなる技術を使用しなければならない。

いくつかの研究でPCRベースの試験の高い感度が実証されており、現在、感度を提供する同じ手順の複数の変異体があります80から100％までの範囲。 本研究では、PCRは80％の感度を有しており、患者はnPCRを通じて感染に陽性であることが確認されただけであり、PCRもイムノクロマト検査もそれを同定することができなかったことに言及することは注目に値する。

カッパ値については、解析した三つの方法の結果をnPCRと比較しました。 臨床診断とｎｐｃｒとの間には悪い一致が示されたが，従来のＰＣＲとｎｐｃｒとの間には中等度の一致が観察された。

臨床徴候に関しては、すべてのウイルス感染患者において嘔吐または下痢のいずれかの存在が観察されたが、他の臨床徴候は感染に関連していないと考えられ、使用された技術の臨床徴候および感受性と一致して、関係は観察されなかった。 例えば、症例no.26は臨床徴候として嘔吐のみを示し、獣医学的臨床診断によってCPV-2に対して陰性とみなされたが、イムノクロマトグラフィー検査、PCRおよびnPCRtestsはCPV-2に対して陽性であった。 さらに、主な臨床徴候が下痢であった症例41および42は、nPCRを用いてCPV-2陽性と診断することができた。

我々のデータは、CPV-2を検出するために臨床および診断獣医研究所で最も頻繁に使用される診断試験は非常に特異的であるが、cpv-2の正確な診断を妨げるtheylack感度であることを示している。 我々の研究では、PCRおよびイムノクロマト検査はnPCRほど敏感ではなかったが、以前の調査で確認されたが、nPCRの診断検査としての使用はまだ獣医病院では広く普及しておらず、研究目的で広く使用されている。

一方、高感度でもあるリアルタイムPCRは、機器コストが高く、取り扱いには高度に専門スタッフが必要であるため、ほとんど使用されていません。 しかし、技術の進歩により、これらの技術は安価で使いやすくなり、CPV-2の診断精度を向上させるために動物病院で直接適用される可能性があります。