TUNELアッセイは、プログラムされた細胞死の一形態であるアポトーシスを受けている細胞を検出するために最も一般的に使用されます。 アポトーシスは、発達中および組織の恒常性を維持するための重要な生物学的プロセスである。 TUNELの汚損はapoptotic細胞の視覚化そして定量化を可能にする。 これは、アポトーシスが癌のように阻害されるか、神経変性のように増強される障害のための新しい治療法の有効性を科学者がテストするのに役立
このビデオでは、tunelアッセイを使用してアポトーシスを受けている細胞を標識する方法、組織切片でこの方法を実行するための段階的なプロトコル、および研究者が細胞死のメカニズムを理解するためにこの技術をどのように適用しているかを説明します。
TUNELアッセイのプロトコルを掘り下げる前に、この手法の背後にある原則について説明しましょう。
アポトーシスの多くの特徴の一つは、DNA断片化です。 DNA断片化はどのように発生しますか？ アポトーシスは、サイトゾル中に存在するカスパーゼと呼ばれる酵素によって行われる。 それらの主な役割は、細胞を解体するためにタンパク質を切断することである。 さらに、カスパーゼは、その阻害剤-ICADからそれをデタッチすることにより、カスパーゼ活性化DNase、またはCADと呼ばれる酵素を活性化します。 活性化されたCADは、核に移動し、染色体DNAを切断するエンドヌクレアーゼである。
DNAの切断は、最終的には端が裂けたDNA断片の蓄積を引き起こし、tunelアッセイは断片化されたDNAのこれらの端が裂けたdnaの蛍光標識し、科学者はアポトーシスを検出することを可能にする。 しかし、これはどのように起こるのですか？ そのためには、TUNEL反応を理解する必要があります。 TUNELは末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介dUTPニックエンドラベリングの略です。 二つの主要なTUNEL試薬は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、またはTdT、およびデオキシウリジン三リン酸、またはdUTPであり、検出を容易にするた
TUNEL反応を理解するために、DNA断片を持つアポトーシス細胞に戻りましょう。 これらの断片は遊離の3’ヒドロキシル基を有する。 アポトーシス細胞を含むサンプルにTUNEL試薬を追加すると、蛍光標識されたdUTPsは、触媒酵素TdTの助けを借りて、これらの3’ヒドロキシル基に付着します。 この手順を使用して染色された細胞は、ＴＵＮＥＬ陽性細胞と呼ばれ、次いで、蛍光顕微鏡を使用して可視化することができる。
TUNELアッセイの背後にある基本的な原則と概念を理解したので、組織切片でこの技術を実行するための一般的なプロトコルを概説しましょう。 TUNELの試金の主要なステップは目的のティッシュの固定、ティッシュのpermeabilization、tunelの試薬を加えること、TUNELの反作用を停止し、そして最終的に分析を含んでいます。
まず、生物学的構造を保存するために、目的の組織を固定する必要があります。 固定は細胞内の蛋白質の架橋結合によって働きます。 ＴＵＮＥＬアッセイのために、４％パラホルムアルデヒドを含有する溶液に４〜２ ４時間４℃で添加することにより、組織を固定することができる。
次のステップは透過性化であり、TdT酵素などの試薬が細胞核に浸透することを可能にする。 組織切片の透過処理は、３ ７℃で５〜１ ５分間、プロテイナーゼＫ溶液に組織を添加することによって行うことができる。
透過処理後、Tunel反応の補因子として作用するコバルトを含む標識緩衝液とともに、TdT酵素と蛍光標識dUTPsを組織切片に添加する。 一緒に、TUNEL反応混合物および組織切片を37℃で1〜3時間インキュベートし、蛍光が退色するのを防ぐために光から保護する。
インキュベーション後、組織切片に停止緩衝液を加えてTUNEL反応を停止させ、短いインキュベーションの後、切片をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。 最後に、蛍光標識されたＤＵＴＰを使用して染色された組織切片を、蛍光顕微鏡を使用して可視化し、所与の組織内のＴＵＮＥＬ陽性細胞の局在について評価する。 所与の組織切片におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合を単純に計数することにより、細胞死を定量化することができる。
アポトーシス細胞を検出するためにTUNELアッセイを実行する方法を見てきたので、このアッセイを使用して細胞生物学者が尋ねた質問に対処する方法
細胞死は、組織や構造の彫刻、および不要な細胞の排除のための開発の正常な部分として発生します。 したがって、この現象に興味のある科学者は、発達中のアポトーシスに対する異なる物質への出生前曝露の影響を研究する。 ここでは、科学者たちは、出生前のアルコール曝露が脳の発達に及ぼす影響を調べることに興味を持っていました。 胎児の脳で行われたTUNEL染色の結果は、対照動物と比較して、出生前にアルコールに曝された組織におけるアポトーシスの増加を明らかにした。
科学者はまた、細菌感染に応答してアポトーシスを調査するためにTUNELアッセイを使用しています。 この実験では、科学者たちは、肺の炎症を誘発する緑膿菌をマウスに注射することによって肺炎のモデルを開発しました。 その後，肺組織を除去し，ＴＵＮＥＬ染色を行い，細菌感染に応答したアポトーシスを調べた。 結果は、対照動物と比較して、細菌に曝されたマウスでアポトーシス細胞死が増加することを示している。
最後に、薬物に対する腫瘍応答性を決定するために、ヒト腫瘍試料に対してTUNEL染色を使用することができる。 この実施例では、腫瘍試料をヒト患者から採取し、ｅ ｘ ｖｉｖｏで培養した。 次に、それらを前臨床薬で処理し、ＴＵＮＥＬアッセイを用いて応答を評価した。 得られたデータは、熱ショックタンパク質90を阻害する薬物による治療が腫瘍組織のアポトーシスを有意に増加させることを示している。
あなたはちょうどアポトーシスを受けている細胞を検出するためにTUNELアッセイを使用してJoVEのビデオを見てきました。 このビデオでは、TUNEL染色の背後にある原理と、組織切片に対してTUNELアッセイを実行するためのステップバイステップのプロトコルをレビューしました。 また，この方法を開発中および疾患中のプログラムされた細胞死を理解するためにどのように適用できるかをレビューした。 いつものように、見てくれてありがとう！
