Multi-farge farging med fluorescerende fargestoffer brukes aktivt for å observere fordelingen av biologiske materialer (som proteiner, lipider, nukleinsyrer og ioner) innen vev og celle forskning. Deteksjonsteknologien for fluorescensobservasjon har avansert til et nivå hvor et enkelt fluorescerende fargestoffmolekyl kan detekteres under de beste omstendigheter. Denne delen gjennomgår flere av de viktige aspektene ved fluorescens lifetime imaging mikroskopi (FLIM), en ny fluorescens mikroskopi teknologi. I tillegg til multi-farge flekker, fluorescens levetid imaging kan også benyttes for å visualisere de faktorer som påvirker fluorescens levetid egenskapene til fargestoff molekylet, det vil si tilstanden i miljøet rundt molekylet.
Bølgelengdespektroskopi
Konvensjonell fluorescensmikroskopi gjør bruk av fargeegenskapene til fluorescerende fargestoffer, det vil si identifikasjon er basert på forskjeller i fluorescensspektrale egenskaper mellom fargestoffer. Med denne teknikken kan fem eller seks farger i bølgelengdeområdet fra ultrafiolett til nær infrarød brukes samtidig under mikroskopi uten forvirring mellom farger.
Livstidsspektroskopi
Hvert fluorescerende fargestoff har sin egen levetid i opphisset tilstand. Ved å oppdage forskjeller i levetid, er det mulig å skille selv fargestoffer som har samme fluorescerende farge, samt å identifisere autofluorescens. Videre kan høye signal-til-støy-bilder oppnås ved å bruke en sonde med svært lang levetid sammenlignet med de fluorescerende fargestoffene som vanligvis brukes. For eksempel har platina coproporfyrin en levetid på millisekund orden mens levetiden til vanlige fluorescerende fargestoffer er av nanosekund orden. Slike relativt langlivede fluorescerende fargestoffer vil snart bli brukt som prober FOR DNA-deteksjon på sjetonger.
Fluorescens levetid imaging gjør det også mulig å få informasjon om molekylene mens observere en levende celle. Faktorene som påvirker fluorescenslevetiden inkluderer ionintensitet, hydrofobe egenskaper, oksygenkonsentrasjon, molekylær binding og molekylær interaksjon ved energioverføring når to proteiner nærmer seg hverandre. Levetiden er imidlertid uavhengig av fargekonsentrasjon, fotobleking, lysspredning og eksitasjonslysintensitet. Derfor tillater fluorescens levetid imaging oss å utføre nøyaktig ion konsentrasjon måling Og Fluorescens Resonans Energioverføring (FRET) analyse.
det finnes to metoder for fluorescens levetid imaging: tid-domene-metoden og frekvens-domene-metoden.
- time-domain FLIM – I noen tilfeller av forsinkelse etter eksitering av en pulslaser, kan fluorescensbildet oppnås ved portens drift av bildeforsterkeren. Levetiden måles i nanosekunder av en laser med en pulsvarighet på noen få hundre pikosekunder og en nanosekundnivå lukker fordi levetiden til en eksitasjonstilstand vanligvis er 1 til 20 nanosekunder. En høyhastighets gate bildeforsterker er kommersielt tilgjengelig Fra Hamamatsu Photonics K. K.(Hamamatsu, Japan). Fluorescenslevetiden ved hver piksel kan også oppnås ved å måle mens du varierer forsinkelsestiden til en port åpnes. Fluorescens levetid bilder er vist i pseudocolor i henhold til deres levetid.
- Frekvens-domene FLIM – Fluorescens levetid beregnes ved å måle faseforskyvningen av fluorescens og reduksjonen i dens amplitude ved hjelp av en detektor med en forsterkningsmodulator når laseren som brukes som eksitasjonslyskilden er modulert (1 til 200 megahertz). Målingen kan tas enten ved laserskanning (photomultiplier) eller ved hjelp av en charge-coupled device (CCD).
Applikasjoner
miljøet rundt sonden oppdages basert på det faktum at fluorescenslevetiden er følsom for hydrogenionkonsentrasjon (pH), oksygen og kalsiumionkonsentrasjoner. Bindingen eller samspillet mellom molekyler kan også måles i kombinasjon med FRET.
Kalsium Ion Konsentrasjon Imaging
når kalsiumion binder seg til en fluorescerende sonde som Fura-2, Fluo-3 Eller Kalsium Grønn, både fluorescens levetid og fluorescens intensitet endring. Den konvensjonelle prosedyren for ionkonsentrasjonsmåling fokuserer på endring i intensitet. Ifølge endringen av kalsiumionkonsentrasjonen endres forholdet mellom fargestoffer mellom bundet og ubundet kalsiumion, og dette fører senere til en endring i fluorescenslevetiden til målepunktet i prøven. I tillegg til kalsiumionsonden er denne teknikken også anvendelig for måling av pH og andre ioner som natriumion og magnesiumion.
Fluorescens Resonans Energioverføring (FRET)
Forskning blir for tiden utført PÅ FRET av grønne fluorescerende protein (GFP) varianter (GFP med en annen fluorescens farge). FRET gjør det mulig å måle interaksjonene (forening eller dissosiasjon) mellom to proteiner som er merket med et par fluorescensfarger. En donor fluorescerende fargestoff har kortere eksitasjon / utslipp bølgelengder som gir energi til en akseptor fluorescens fargestoff. Levetiden til eksitasjonstilstanden til donorfargen er variabel avhengig av om akseptoren (fargestoffet som mottar energien) eksisterer eller ikke. Måling basert på levetid tillater bedre kvantifisering fordi det ikke er nødvendig å vurdere overlappingen av fluorescens under deteksjon.
Klinisk Bildebehandling
som noen vev og cytodiagnostiske prøver har sterk autofluorescens, har bruk av sonder med lang levetid (opptil millisekunder) blitt forsøkt. Lang levetid sonder er også nyttig I Fluorescens in situ hybridisering (FISK) fordi antall farger som kan brukes samtidig er begrenset med denne teknikken. Hydrogenionkonsentrasjonen i blod, samt oksygen-og karbondioksidtrykket, er allerede målt basert på fluorescenslevetid, selv om slike målinger fortsatt ikke er mulige under mikroskopi.
Internett-Ressurser
- Senter For Fluorescensspektroskopi-Hostet Av Professor Joseph R. Lakowicz ved University Of Maryland, dette nettstedet er en utmerket ressurs for informasjon om fluorescens levetid imaging og andre aspekter av fluorescens spektroskopi og mikroskopi.
- Kentech Instruments-Kentech produserer høy spenning solid state puls generatorer og optisk gated imaging systemer for fluorescens levetid imaging.
- Hamamatsu Photonics-I tillegg til deres utmerkede utvalg av digitale kamerasystemer, produserer Hamamatsu også fotomultiplikatorer, lavine fotodioder og høyhastighets gate bildeforsterker.
- PRS BioSciences – Spesialiserer seg på biologisk fluorescens mikroskopi, prs BioSciences produserer en ettermarkedet tid-gated system som kan tilpasses mange forskning mikroskop.
