10.4.2 Trehalose for kryopreservering av pattedyrceller
Kryopreservering har vært vanlig for bevaring av celler over lengre perioder ved ekstremt lave temperaturer. Imidlertid kan fysiske endringer som oppstår under frysing og tining være skadelig for celleoverlevelse og funksjoner. Derfor må kryobeskyttende midler legges til cellene under kryopreservering. Bruken av trehalose som kryobeskyttende middel for celler oppsto fra forestillingen om at polyhydroksyforbindelser kreves på begge sider av cellemembranen for at cellene skal bevares i lengre perioder . Trehalose har blitt utforsket av flere grupper som et beskyttende middel for kryopreservering av forskjellige humane celler.
Beattie et al. introdusert trehalose sammen MED DMSO i bukspyttkjertel Langerhans celler ved hjelp av termotrop væskefaseovergang . Kryopreservering med trehalose resulterte i 92% bedring av voksne holmer, sammenlignet med kun 58% bedring ved BRUK AV DMSO alene. Fjorten ganger mer insulin ble funnet i grafts fra holmer cryopreservert med trehalose enn de uten trehalose. Gjenvinningen av kryopreservert med trehalose hos humane føtale holmer (iccs) var 94%, sammenlignet med bare 42% for de uten trehalose. Ved transplantasjon i nakne mus ble det observert en 15 ganger økning i insulininnholdet i transplantater FRA ICC-kryopreservert med trehalose. Disse resultatene indikerer at tilsetningen av trehalose som kryopreserver fører til svært høy overlevelse av humant pankreatisk endokrine vev.
Toner og kollegaer introduserte lave konsentrasjoner av trehalose i pattedyrceller ved hjelp av en genetisk utviklet versjon av det poredannende proteinet alfa-hemolysin, og fant at intracellulær trehalose i stor grad kan forbedre overlevelsen av disse cellene under kryopreservering . Langtidsoverlevelsesrate etter tining av kryopreserverte musefibroblaster og humane keratinocytter var henholdsvis 80% og 70% ved en intracellulær trehalosekonsentrasjon på 0,2 M. Intracellulær trehalose ble også funnet å ha gunstig effekt på membranintegriteten til tørkede pattedyrceller, med mer enn 90% gjenvinning av intakt plasmamembran observert ved tørking og lagring av cellene under milde forhold i flere uker .
effekten av trehalose på kryopreservering av humane hepatocytter ble undersøkt Av Katenz et al. . Leverceller frosset i kulturmedium med 10% DMSO og 0,2 M trehalose viste signifikant forbedring i levedyktigheten og platingeffektiviteten etter tining sammenlignet med DMSO alene. Tilstedeværelsen av trehalose under kryopreservering resulterte også i økt totalt proteinnivå i de vedlagte cellene, høyere albumin-sekresjonsnivåer og lavere aspartat-aminotransferasenivåer etter tining.
Stamceller er viktige verktøy for undersøkelse av hematopoiesis, utvikling av nye terapeutiske strategier samt modellsystemer for visse sykdommer. Til tross for utviklingen i kryopreservering er post-thaw celledød fortsatt et stort problem. Martinetti et al. brukt trehalose til å kryopreservere rene hematopoietiske stamceller og stamceller fra perifert blod for å forhindre celletap som oppstår under normal kryopreservering . Uttrykket av overflatestammemarkøren CD34 ble evaluert, og 1 M trehalose ble funnet å gi forbedret kryobeskyttelse TIL CD34 + – celler med høyere celletall og celleviabilitet sammenlignet med standardfrysemetoden ved BRUK AV DMSO. Videre beholdt kryopreservering med trehalose i kortere og lengre perioder CD34 + – cellers evne til å differensiere til megakaryopoietiske celler etter tining. Disse resultatene tyder på trehaloses evne til å beholde levedyktigheten og funksjonene til stamceller når de brukes som kryobeskyttende middel.
langtidslagring av røde blodceller (Rbc) og blodplater og samtidig opprettholde høy grad av levedyktighet har viktige implikasjoner i blodoverføring og klinisk medisin. Satpathy et al. beskrevet en metode for å laste Rbc med trehalose fra et ekstracellulært medium ved hjelp av osmotisk ubalanse og fosfolipidfaseovergang som resulterte i intracellulære trehalosekonsentrasjoner på 40 mM . Trehalose ble funnet å utøve osmotisk beskyttelse Av Rbc i lengre perioder. Frysetørking av trehalosebelastede Rbc etterfulgt av rehydrering resulterte i 55% overlevelse med retensjon av deres morfologi. De overlevende cellene syntetiserte ATP og 2,3-difosfoglyserat (DPG) og hadde lave nivåer av metemoglobin. Aktiviteten AV SOD og katalase og den sekundære strukturen av hemoglobin i de frysetørkede RBCs var alle veldig lik de av friske RBCs. Denne studien viste at trehalosebelastning var nødvendig for stabilisering av hemoglobin og ga et viktig skritt mot kryopreservering av Rbc.
normal lagringstid for humane blodplater i blodbanker er 5 dager etter at de kastes, noe som resulterer i kronisk mangel på blodplater som kreves for transfusjon. Som en innsats mot kryopreservering av blodplater i lengre perioder, Wolkers et al. beskrevet en metode for innføring av trehalose i cytoplasma av humane blodplater . Det ble funnet at trehalose lett ble tatt opp av humane blodplater ved 37°C med en belastningseffektivitet på mer enn 50%. Frysetørking og rehydrering av trehalosebelastede blodplater resulterte i utmerket gjenvinning av intakte blodplater med overlevelsesrate på 85%. Disse blodplater reagerte på en nesten identisk måte som ferske blodplater mot agonister som trombin, ADP, kollagen og ristocetin. Membranmikrodomenene og proteinkomponentene i trehalosebelastede blodplater ble opprettholdt intakt etter frysetørking og rehydrering.
den beskyttende effekten av trehalose ble også vist i fortynnede hornhinneepitelceller. Preincubation av dyrkede hornhinneepitelceller med trehalose etterfulgt av tørking resulterte i signifikant reduksjon i prosentandelen av døde celler, sammenlignet med kontrollmediet . Den beskyttende effekten ble også bekreftet ex vivo i enucleated porcine eyes, hvor vevet inkubert med trehalose var synlig jevnere . Disse resultatene indikerer bruken av trehalose i oftalmologi og dens potensielle anvendelse som øyedråper for tørrøysyndrom.
bruken av trehalose for kryopreservering av organeller har blitt demonstrert Av Yamaguchi et al., som brukte trehalose som kryoprotektant for frosne mitokondrier . Mitokondrier frosset i nærvær av trehalose viste mitokondriell ytre membran (MOM) integritet og respons på Bcl-2 familieproteiner som ligner på friske mitokondrier. Ultrastruktur, ATP-syntese, transmembranpotensial, kalsiumindusert hevelse og import og behandling av forløperproteiner ble også bevart i nærvær av trehalose. Dette er i motsetning til standard sukrose-mannitolbuffer som brukes til frysing av mitokondrier som ofte blir lekkende. Dermed var trehalose i stand til å beholde de fleste biologiske egenskapene til mitokondrier og trehalose-frosne mitokondrier kan brukes til forskning på apoptose og andre mitokondrielle funksjoner som stole på MOM-integritet.
Trehalose har blitt brukt til bevaring av organer over lengre perioder. En «Et-Kyoto-løsning» ble utviklet av Wadas gruppe for bevaring av hundens lunge i > 30 timer uten å påvirke ytelsen til endotelceller og vaskulatur . Langvarig stabilisering og bevaring av vaksiner og antistoffer er også oppnådd ved bruk av trehalose.
