Metoder For Proteinrensing: 4 Metoder

Denne artikkelen kaster lys over de fire metodene for proteinrensing.

de fire metodene for proteinrensing er: (1) Ekstraksjon (2) Utfelling Og Differensiell Solubilisering (3)Ultracentrifugering og (4) Kromatografiske Metoder.

metodene som brukes i proteinrensing, kan grovt deles inn i analytiske og preparative metoder.

forskjellen er ikke nøyaktig,men den avgjørende faktoren er mengden protein som praktisk talt kan renses med den metoden. Analysemetoder tar sikte på å oppdage og identifisere et protein i en blanding, mens preparative metoder tar sikte på å produsere store mengder protein til andre formål, for eksempel strukturbiologi eller industriell bruk. Generelt kan preparative metoder brukes i analytiske applikasjoner, men ikke omvendt.

Metode # 1. Utvinning:

avhengig av kilden, må proteinet bringes i oppløsning ved å bryte vevet eller cellene som inneholder det. Det finnes flere metoder for å oppnå Dette; Gjentatt frysing og tining, sonikering, homogenisering ved høyt trykk eller permeabilisering av organiske løsningsmidler. Valgmetoden avhenger av hvor skjøre proteinet er og hvor solid cellene er.

etter denne ekstraksjonsprosessen løselig protein vil være i løsningsmidlet, og kan skilles fra cellemembraner, DNA, etc. ved sentrifugering. Ekstraksjonsprosessen trekker også ut proteaser, som vil begynne å fordøye proteinene i løsningen. Hvis proteinet er følsomt for proteolyse, er det vanligvis ønskelig å fortsette raskt, og holde ekstraktet avkjølt, for å redusere proteolyse.

Metode # 2. Nedbør Og Differensiell Solubilisering:

i bulkproteinrensing er et vanlig første trinn for å isolere proteiner nedbør med ammoniumsulfat (NH4)2SO4. Dette utføres ved å tilsette økende mengder ammoniumsulfat og samle de forskjellige fraksjonene av utfellingsprotein. En fordel med denne metoden er at den kan utføres billig med svært store mengder.

de første proteinene som skal renses er vannløselige proteiner. Rensing av integrerte membranproteiner krever forstyrrelse av cellemembranen for å isolere et bestemt protein fra andre som er i samme membranrom. Noen ganger kan en bestemt membrantrekk isoleres først, for eksempel å isolere mitokondrier fra celler før rensing av et protein som ligger i en mitokondriamembran.

et vaskemiddel som natriumdodecylsulfat (sds) kan brukes til å oppløse cellemembraner og holde membranproteiner i oppløsning under rensing; men fordi SDS forårsaker denaturering, kan mildere vaskemidler som Triton X-100 eller CHAPS brukes til å beholde proteinets innfødte konformasjon under rensing.

Metode # 3. Ultracentrifugering:

Sentrifugering Er en Prosess som bruker sentrifugalkraft til å skille blandinger av partikler med varierende masser eller tettheter suspendert i en væske. Når et fartøy (vanligvis et rør eller en flaske) som inneholder en blanding av proteiner eller andre partikler, som bakterieceller, roteres med høye hastigheter, gir vinkelmomentet en utadgående kraft til hver partikkel som er proporsjonal med massen.

tendensen til en gitt partikkel til å bevege seg gjennom væsken på grunn av denne kraften kompenseres av motstanden væsken utøver på partikkelen. Nettoeffekten av å» spinne » prøven i en sentrifuge er at massive, små og tette partikler beveger seg utover raskere enn mindre massive partikler eller partikler med mer «dra» i væsken.

når suspensjoner av partikler blir «spunnet» i en sentrifuge, kan en «pellet» dannes i bunnen av fartøyet som er beriket for de mest massive partiklene med lav motstand i væsken. De resterende, ikke-komprimerte partiklene som fortsatt er mest i væsken, kalles «supernatanten» og kan fjernes fra fartøyet for å skille supernatanten fra pelleten.

sentrifugeringshastigheten er spesifisert av vinkelakselerasjonen påført prøven, vanligvis målt i forhold til g. Hvis prøvene sentrifugeres lenge nok, vil partiklene i karet nå likevekt hvor partiklene akkumuleres spesifikt på et punkt i karet hvor deres flytende tetthet er balansert med sentrifugalkraften. En slik» likevekt » sentrifugering kan tillate omfattende rensing av en gitt partikkel.

Sukrose gradient sentrifugering:

en lineær konsentrasjonsgradient av sukker (typisk sukroseglycerol eller Percoll) genereres i et rør slik at den høyeste konsentrasjonen er på bunnen og lavest på toppen. En proteinprøve blir deretter lagdelt på toppen av gradienten og spunnet ved høye hastigheter i en ultracentrifuge. Dette fører til at tunge makromolekyler migrerer mot bunnen av røret raskere enn lettere materiale.

under sentrifugering i fravær av sukrose, da partikler beveger seg lenger og lenger fra rotasjonssenteret, opplever de mer og mer sentrifugalkraft (jo lenger de beveger seg, desto raskere beveger de seg). Problemet med dette er at det nyttige separasjonsområdet i fartøyet er begrenset til et lite observerbart vindu.

Spinning en prøve dobbelt så lenge betyr ikke at partikkelen av interesse vil gå dobbelt så langt; faktisk vil det gå betydelig lenger. Men når proteinene beveger seg gjennom en sukrosegradient, møter de væske med økende tetthet og viskositet.

en riktig utformet sukrosegradient vil motvirke den økende sentrifugalkraften, slik at partiklene beveger seg i nært forhold til tiden de har vært i sentrifugalfeltet. Prøver adskilt av disse gradienter er referert til som» rate zonal » sentrifugeringer. Etter separering av proteinet/partiklene blir gradienten deretter fraksjonert og samlet.

Metode # 4. Kromatografiske Metoder:

vanligvis inneholder en proteinrensingsprotokoll ett eller flere kromatografiske trinn. Den grunnleggende prosedyren i kromatografi er å strømme oppløsningen som inneholder proteinet gjennom en kolonne fullpakket med forskjellige materialer. Ulike proteiner interagerer forskjellig med kolonnematerialet, og kan dermed separeres av tiden som kreves for å passere kolonnen, eller betingelsene som kreves for å eluere proteinet fra kolonnen. Vanligvis oppdages proteiner når de kommer av kolonnen ved deres absorpsjon ved 280 nm.

Det Finnes Mange forskjellige kromatografiske metoder:

1. Kromatografi:

Kromatografi kan brukes til å separere protein i oppløsning eller denatureringsforhold ved bruk av porøse geler. Denne teknikken er kjent som størrelse eksklusjon kromatografi. Prinsippet er at mindre molekyler må krysse et større volum i en porøs matrise. Følgelig vil proteiner av et bestemt område i størrelse kreve et variabelt volum eluant (løsningsmiddel) før de samles i den andre enden av gelkolonnen.

i sammenheng med proteinrensing blir eluanten vanligvis samlet i forskjellige reagensrør. Alle reagensrør som ikke inneholder målbare spor av proteinet for å rense, kasseres. Den gjenværende løsningen er således laget av proteinet for å rense og andre tilsvarende proteiner.

2. Ionebyttekromatografi:

Ionebyttekromatografi separerer forbindelser i henhold til naturen og graden av deres ioniske ladning. Kolonnen som skal brukes, er valgt i henhold til type og styrke av ladning. Anionbytterharpikser har en positiv ladning og brukes til å beholde og skille negativt ladede com pounds, mens kationbytterharpikser har en negativ ladning og brukes til å skille positivt ladede molekyler.

før separasjonen begynner, pumpes en buffer gjennom kolonnen for å balansere de motsatte ladede ioner. Ved injeksjon av prøven vil løsningsmolekyler bytte ut med bufferioner som hver konkurrerer om bindingsstedene på harpiksen. Lengden på oppbevaring for hvert stoff avhenger av styrken av ladningen.

de mest svakt ladede forbindelsene vil eluere først, etterfulgt av de med suksessivt sterkere ladninger. På grunn av arten av separasjonsmekanismen spiller pH, buffertype, bufferkonsentrasjon og temperatur alle viktige roller i å kontrollere separasjonen. Ionbytterkromatografi er et meget kraftig verktøy for bruk i proteinrensing og brukes ofte i både analytiske og preparative separasjoner.

3. Affinitetskromatografi:

Affinitetskromatografi er en separasjonsteknikk basert på molekylær konformasjon, som ofte benytter applikasjonsspesifikke harpikser. Disse harpikser har ligander festet til deres overflater som er spesifikke for forbindelsene som skal skilles. Oftest fungerer disse ligandene på en måte som ligner på antistoff-antigen-interaksjoner. Denne «lås og nøkkel» – passformen mellom liganden og målforbindelsen gjør den svært spesifikk, og genererer ofte en enkelt topp, mens alt annet i prøven ikke er beholdt.

Mange membranproteiner er glykoproteiner og kan renses ved lektinaffinitetskromatografi. Vaskemiddeloppløsede proteiner kan få lov til å binde seg til en kromatografiharpiks som har blitt modifisert for å ha et kovalent festet lektin.

Proteiner som ikke binder seg til lektin vaskes bort og deretter spesifikt bundet glykoproteiner kan elueres ved å tilsette en høy konsentrasjon av et sukker som konkurrerer med de bundet glykoproteiner på lektin bindingsstedet. Noen lektiner har høy affinitetsbinding til oligosakkarider av glykoproteiner som er vanskelig å konkurrere med sukkerarter, og bundet glykoproteiner må frigjøres ved denaturering av lektinet.

4. Metallbinding:

en vanlig teknikk innebærer å konstruere en sekvens på 6 til 8 histidiner i Proteinets C-terminal. Polyhistidin binder seg sterkt til divalente metallioner som nikkel og kobolt. Proteinet kan føres gjennom en kolonne som inneholder immobiliserte nikkelioner, som binder polyhistidin-taggen. Alle untagged proteiner passerer gjennom kolonnen.

proteinet kan elueres med imidazol, som konkurrerer med polyhistidin-taggen for binding til kolonnen, eller ved en reduksjon i pH (typisk til 4,5), noe som reduserer affiniteten til taggen for harpiksen. Selv om denne prosedyren vanligvis brukes til rensing av rekombinante proteiner med en konstruert affinitetskode (for eksempel en 6xHis-tag eller Clontechs HAT-tag), kan Den også brukes til naturlige proteiner med en iboende affinitet tor divalente kationer.

5. Immunoaffinitetskromatografi:

Immunoaffinitetskromatografi bruker den spesifikke bindingen av et antistoff til målproteinet for å selektivt rense proteinet. Prosedyren innebærer immobilisering av et antistoff til et kolonnemateriale, som deretter selektivt binder proteinet, mens alt annet strømmer gjennom. Proteinet kan ix elueres ved å endre pH eller saltholdigheten. Fordi denne metoden ikke involverer engineering i en tag, kan den brukes til proteiner fra naturlige kilder.

6. HPLC:

Væskekromatografi Med høy ytelse eller væskekromatografi med høyt trykk er en form for kromatografi som bruker høyt trykk for å drive løsningsmidlene raskere gjennom kolonnen. Dette betyr at diffusjonen er begrenset og oppløsningen er forbedret. Den vanligste formen er» reversert fase » HPLC, hvor kolonnematerialet er hydrofobt.

proteinene elueres av en gradient av økende mengder av et organisk løsningsmiddel, slik som acetonitril. Proteinene eluerer i henhold til deres hydrofobicitet. Etter rensing AV HPLC er proteinet i en løsning som bare inneholder flyktige forbindelser, og kan lett fryses. HPLC-rensing resulterer ofte i denaturering av de rensede proteinene og er derfor ikke anvendelig for proteiner som ikke spontant refoldes.