ABSTRACT
Influensavirus neuraminidase (NA) spiller en viktig rolle i frigjøring og spredning av avkom virioner, etter intracellulær viral replikasjon syklus. For å teste OM NA også kunne lette virusinntrengning i celle, infiserte vi kulturer av humant luftveisepitel med humane og aviær influensavirus i nærvær AV NA-inhibitoren oseltamivirkarboksylat. Tjue til 500 ganger færre celler ble infisert i legemiddelbehandlede versus ikke-behandlede kulturer (P < 0,0001) 7 timer etter virusapplikasjon, noe som indikerer at stoffet undertrykte initieringen av infeksjon. Disse dataene viser at viral NA spiller en rolle tidlig i infeksjon, og de gir ytterligere begrunnelse for profylaktisk bruk AV NA-hemmere.
det antas at hovedfunksjonen til viral neuraminidase (NA) er i sluttfasen av infeksjon når NA spalter sialinsyre fra celleoverflaten og avkomvirioner som letter virusfrigjøring fra infiserte celler (1, 2). Mindre er kjent OM NA-funksjoner under virusinngang i cellen. DET har lenge vært antatt AT NA fremmer virustilgang til målceller i luftveiene ved slimforringelse (3). Dette konseptet har imidlertid aldri blitt formelt bevist på grunn av mangelen på et tilstrekkelig eksperimentelt system. Videre er det rapportert noen bevis som argumenterer MOT NA-rollen i de tidlige stadiene av infeksjon (gjennomgått i referanse 2).
for å løse dette problemet, studerte VI effekten AV na-inhibitoren oseltamivirkarboksylat (OC) (9) på influensavirusinntrengning i kulturer av humant luftveisepitel. Primære humane trakeobronkiale epitelceller (HTBE; Klonetikk) og primære nasale epitelceller (PromoCell GmbH) ble dyrket på membranstøtter (12 mm Transwell-Clear; Corning, Inc.) ved luft-væske grensesnitt i serum-fri vekstfaktor og hormon-supplert medium (6, 8). Fullt differensierte 4 til 8 uker gamle kulturer ble brukt til alle eksperimenter. Disse kulturene var pseudostratifiserte og polariserte; inneholdt basale, cilierte og slim-sekreterende celler; og lignet tett menneskelig luftveisepitel in vivo (Fig. 1). OC (1 µ, hvis ikke annet er angitt) ble lagt til virussuspensjoner og til basolaterale rom i kulturene kort tid før infeksjon av to replikatkulturer fra apikalsiden. To kontrollkulturer ble infisert i fravær av inhibitor. En time etter infeksjon fjernet vi virusinokulumet og inkuberte kulturer ved luft-væske-grensesnittet for ytterligere 6 timer for å tillate intracellulær virusreplikasjon. Kulturer ble deretter løst, og infiserte celler ble identifisert ved farging med polyklonal antisera til hele virus etterfulgt av tilsvarende peroksidase-merkede sekundære antistoffer (Dianova) og aminoetylkarbazolsubstrat (Sigma). Positiv farging indikerte vellykket virusoppføring i cellen. Kulturene ble analysert en ansikt ved en forstørrelse av ×300 (Olympus IMT-2). Et totalt antall celler som uttrykker viralt antigen ble talt i epitelsegmentet som inkluderte alle påfølgende mikroskopiske visninger (0.28 av 0.42 mm) langs diameteren av kulturen (segment overflateareal, 3 mm2; antall celler per segment, ca 30.000). Fire segmenter per kultur ble talt ved å rotere kulturen med klokken av 45o. dataene for åtte segmenter av to replikatkulturer ble i gjennomsnitt.
i to eksperimenter med HTBE-kulturer infiserte det humane viruset A/Memphis/14/96 (H1N1) 22-og 65-ganger færre celler i NÆRVÆR AV NA-hemmer sammenlignet med kontroller (Fig . 2; Tabell 1) (P < 0,0001). Virus A / Duck/Alberta/119 / 98 (H1N1) fra en vill akvatisk fugl og A / Turkey / Italy / 2379 / 99 (H7N1) fra husdyr var også markert følsomme for OC i disse kulturene. I nasale epitelkulturer reduserte OC infeksjon med menneske-og andevirus henholdsvis 120 og 520 ganger. Disse resultatene indikerte at hemming AV viral NA undertrykker initiering av virusinfeksjon.
A/Chicken/Germany/R28 / 03 (H7N7) tilhører den høypatogene fugleinfluensavirusen som forårsaket utbrudd av fuglepest i kommersielle fjærfe gårder I Nederland, Belgia og Tyskland i 2003. Disse virusene ble overført til minst 89 mennesker, hvorav de fleste hadde konjunktivitt, men ett dødelig tilfelle av lungebetennelse forekom også (5). H7n7 kyllingvirusinfeksjonen i HTBE-kulturer ble redusert 140-og 40-ganger ved tilstedeværelse av henholdsvis 1 og 0,1 µ OC. Disse konsentrasjonene representerte typiske maksimale og minimale plasmakonsentrasjoner av legemiddel oppnådd hos mennesker etter administrering av 75 mg oseltamivirfosfat, den anbefalte dosen for profylakse (9).
for å bekrefte hypotesen om at infeksjonshemming i våre eksperimenter var direkte relatert til inhibering AV viral NA enzymatisk aktivitet, brukte vi human A / Sydney/5/97-som virus (H3N2) og dets oseltamivir-resistente mutant med en r292k-substitusjon I NA, som gjør NA 9000 ganger mindre følsom for hemming av OC (4). I samsvar med hypotesen ble det overordnede humane viruset sterkt hemmet av OC, mens bare et marginalt nivå av inhibering av resistent mutant ble observert når begge virusene ble testet i samme eksperiment I HTBE-kulturer (Tabell 1). Hittil har det ikke vært tilstrekkelig cellekulturanalyse tilgjengelig for overvåking av influensavirusresistens mot NA-hemmere på grunn av misforholdet mellom sialinsyrereseptorer hos mennesker og i konvensjonelle laboratoriecellelinjer (9, 11). Våre resultater tyder på at differensierte kulturer av humant luftveisepitel kan være et egnet cellekultursystem for påvisning av influensavirusresistens mot NA-hemmere.
Til Slutt, bruk av stofffølsom A / Sydney/5/97-som virus, vi testet infeksjon hemming AV OC lagt til forskjellige tider etter virus inokulering. Mens 47 ganger færre celler ble infisert da legemidlet ble tilsatt kort tid før infeksjonen, resulterte en 1-h forsinkelse i tillegg TIL OC i bare 1,5 ganger hemming med hensyn til den ikke-behandlede kontrollen (Tabell 1). Hvis stoffet ble tilsatt 4 h etter virusinokulering, ble det ikke observert statistisk signifikant inhibering. Disse dataene antydet AT OC påvirket de tidligste stadiene av infeksjon før virusreplikasjon.
i sammendraget, har vi gitt her for første gang direkte eksperimentelle bevis FOR den essensielle rolle NA på scenen av virus invasjon av ciliated epitel av humane luftveier. NA-funksjonen på dette stadiet er mest sannsynlig fjerning av lokkedue reseptorer på mucins, cilia, og cellulær glycocalix, sterk binding til hver av disse ville hindre virus tilgang til funksjonelle reseptorer på overflaten membran av målceller. Imidlertid kan ANDRE NA—funksjoner-for eksempel fremme av hemagglutinin—mediert fusjon (7) – ikke utelukkes, og videre studier er nødvendig for å spesifisere de nøyaktige mekanismene SOM NA fremmer virusinngang i luftveisepitelceller.
med ingen vaksine tilgjengelig ennå mot høypatogene h7n7-og H5N1-fugleinfluensavirus, forblir antivirale legemidler det eneste alternativet for å bekjempe fugleinfluensa (10). SAMMENLIGNET med ANDRE anti-influensa-midler, ER NA-hemmere godt tolerert og effektive mot alle stammer av influensa a-og b-virus. Det har vært lite bevis på fremveksten av viral resistens, og smittsomheten av mutantvirus er vanligvis kompromittert (9, 11). EVNEN TIL na-hemmere til å undertrykke infeksjon før virusinngang i celler understreker deres høye potensial for forebyggende tiltak. Spesielt gir våre data det vitenskapelige grunnlaget for å støtte profylaktisk bruk av disse forbindelsene for personer med høy risiko for infeksjon med aviær influensavirus.
