Blotting Teknikker
Blotting brukes i molekylærbiologi for identifisering av proteiner og nukleinsyrer og er mye brukt for diagnostiske formål. Denne teknikken immobiliserer molekylet av interesse på en støtte, som er en nitrocellulosisk membran eller nylon. Den bruker hybridiseringsteknikker for identifisering av de spesifikke nukleinsyrer og gener.
blotting teknikken er et verktøy som brukes i identifisering av biomolekyler som ad DNA, mRNA og protein under ulike stadier av genuttrykk. Proteinsyntese innebærer uttrykk FOR ET DNA-segment som blir omdannet til mRNA for å produsere det respektive proteinet.
Subtyper av blotting som nordlige, vestlige & sørlige avhenger av målet molekylet som blir søkt. NÅR EN DNA-sekvens er grunnlaget eller koden for et proteinmolekyl, kan det spesielle DNA-molekylet av interesse bli slettet ved Hjelp Av Southern Blotting teknikk. Under genuttrykk, når DNA uttrykkes som mRNA for en proteinproduksjon, kan denne prosessen identifiseres Ved Northern blotting. Til slutt produserer den kodede mRNA det aktuelle proteinet, denne proteinidentifikasjonen kan gjøres Ved Western Blotting.
Generell prosedyre for blotting
- Homogeniser prøven.
- Separasjon av molekylet av interesse ved en elektroforese membran.
- Overføre molekylene til en nitro cellulosemembran / nylon membran.
- Hybridisering eller identifikasjon av molekylet
Northern Blotting
Northern Blotting er en teknikk som brukes for studier av genuttrykk. Det gjøres ved deteksjon av bestemt RNA (eller isolert mRNA). mRNA er vanligvis representert som 5% av den totale rna-sekvensen. Denne metoden avslører identitet, antall, aktivitet og størrelse på det bestemte genet. Denne blotting teknikken kan også brukes til vekst av et vev eller organisme. I forskjellige stadier av differensiering og morfogenese endres overflod AV ET RNA, og dette kan identifiseres ved hjelp av denne teknikken. Det hjelper også i identifisering av unormal, syk eller infisert tilstand på molekylært nivå. Northern blot-teknikken ble utviklet i 1977 Av James Alwine, David Kemp og George Stank ved Stanford University. Teknikken fikk navnet sitt på grunn av likheten i prosessen Med Southern blotting. Den primære forskjellen mellom disse to teknikkene er at northern blotting bare gjelder RNA.
Prinsipp
som all normal blotting teknikk, starter northern blotting med elektroforese å skille RNA prøver etter størrelse. Elektroforese separerer rna-molekylene basert på ladningen av nukleinsyrene. Ladningen i nukleinsyrene er proporsjonal med størrelsen på nukleinsyresekvensen. Således separerer elektroforesemembranen Nukleinsyresekvensen i henhold til størrelsen PÅ RNA-sekvensen. I tilfeller der vår målsekvens er en mRNA, kan prøven isoleres gjennom oligo cellulose kromatografiske teknikker, da mRNA er preget av poly(A)-halen. Siden gelmolekyler er skjøre i naturen, overføres de separerte sekvensene til nylonmembranene. Valget av nylonmembran bidrar til faktoren at nukleinsyrer er negativt ladet i naturen. NÅR RNA-molekylene er overført det er immobilisert av kovalent kobling. Sonden blir deretter tilsatt, sonden kan være komplementær en ss DNA-sekvens. Formamid brukes vanligvis som en blotting buffer som det reduserer glødetemperaturen.
Prosedyre
- vev-eller kulturprøven som samles inn, blir først homogenisert. Prøvene kan være representative for ulike typer kultur for sammenligning, eller det kan være for studiet av ulike stadier av vekst inne i kulturen.
- rna-sekvensen separeres i elektroforese-enheten en agarosegel brukes til formålet med nukleinsyreseparasjonen.
- nå overføres den separerte RNA-sekvensen til nylonmembranen. Dette gjøres ved to mekanismer kapillær handling og ionisk interaksjon.
- overføringen gjøres ved å holde gelen i følgende rekkefølge. Først plasseres agarosegelen på bunnen av stabelen, etterfulgt av blotting membranen. På toppen av disse papirhåndklær er en mild vekt (glassplate) plassert. Hele oppsettet holdes i et beger som inneholder overføringsbuffer.
- rna overført til nylonmembranen blir deretter festet VED HJELP AV UV-stråling.
- den faste nylonmembranen blandes deretter med prober. Probene er spesielt utviklet for genet av interesse, slik at de vil hybridisere MED RNA-sekvenser på blottet som svarer til sekvensen av interesse.
- blotmembranen vaskes for å fjerne uønsket probe
- Merket probe oppdages ved kjemiluminescens eller autoradiografi. Resultatet blir mørke bånd i røntgenfilm.
GEl Og Prober
rna-prøvene separeres ved hjelp av agarosegeler ved bruk av formaldehyd som denatureringsmidler, men i små RNA-eller mikro-RNA-sekvenser kan polyakrylamidsekvenser Med urea som denatureringsmiddel også brukes. Etidiumbromid kan brukes som fargemiddel. To typer markører er for størrelsesmerking. En rna-stige og ribosomal subenhet brukes til å identifisere størrelsen PÅ RNA-sekvensene.
Prober kan være komplementære til hele ELLER deler AV rna av interesse. DE kan VÆRE RNA, DNA eller oligonukleotider av 25 komplementære basepar til mål-RNA. Ved RNA-prober brukes invitro-produserte prober, da invivo-prober kan denaturere på grunn av den strenge vasken. Ved cDNA er probene merket med radioaktive isotoper, alkalisk fosfatase eller pepperrotperoksidase ved kjemiluminescens.
