Onkologirapporter

Innledning

selv om nye terapier nylig har blitt introdusert i klinisk praksis for behandling av avansert kreft, har prostatakreft vært den nest dødeligste kreft hos menn i Usa i 2014 (1). Nye terapeutiske mål og strategierer presset for å ytterligere forbedre det kliniske resultatet avpasienter med prostatakreft.

et lovende potensielt terapeutisk mål iscyklinavhengig kinase 5 (CDK5). CDK5 er en serin / treoninkinasestrukturelt lik andre Cdk-Er (2). CDK5 ser ikke ut til å ha en storrolle i cellesyklusregulering (3,4). Dethar vært godt karakterisert for sin dominerende rolle iutvikling av sentralnervesystemet, inkludert roller ineuronal migrasjon, differensiering og adhesjon (5,6). Weand andre viste senere AT CDK5 spiller en viktig rolle ikreftutvikling og metastase (7-12). Inprostate kreftceller viste VI AT CDK5 var kritisk forcytoskeletal integritet, cellemigrasjon og invasjon, og invivo, for metastase (7). Inpancreatic cancer, CDK5 er iboende FOR KRAS-signalering gjennom den sentralt viktige ral-signaltransduksjonsveien, og gir dermed et potensielt ‘druggable’ mål for mutante KRAS-svulster (8). Sammen indikerer disse studiene detinhibering AV CDK5, alene eller i kombinasjon med andre midler, kangi en effektiv terapeutisk strategi for disse og andrekrefttyper.

i denne studien bestemte vi oss for å identifisere midler som ville være spesielt effektive i kombinasjon med CDK5inhibition i prostatakreftceller. Derfor utførte vi ascreen Av Johns Hopkins Drug Library (JHDL). JHDL er en samling av 3,360 farmasøytiske forbindelser som har vellykket sikkerhetstesting hos mennesker for en rekke applikasjoner(13,14). Dette biblioteket har blitt brukt til gjenbruk av forbindelser for kreftbehandling, inkludert identifisering av digoksin Som HIF1a-hemmer (15) og itrakonazol som angiogeneseinhibitor (16). Vi brukte tidligere JHDL til å identifisere cetrimoniumbromid og irinotekan som forbindelser med økt antitumoraktivitet mot prostatakreftceller som uttrykker lave nivåer Av metastasesuppressorgen N-mycdownregulert gen 1 (NDRG1) (17).Her utførte vi en lignende jhdl-screening med prostatakreftceller som varierer I CDK5-aktivitet. Tiloron ble identifisert som en forbindelse med in vitro syntetisk dødelighet inCDK5-mangelfulle prostatakreftceller.

Materialer og metoder

Cellekultur

PC3 prostata kreftcellelinjer ble oppnådd fraatcc. Disse cellene er avledet fra en benmetastase fra en 62-årig prostatakreft pasient. Humane prostatafibroblaster, kindlyproved Av Dr J. Isaacs, ble oppnådd fra en prostatabiopsi på a62-årig prostatakreft pasient Med En Gleason score på 4. Bothcell linjer ble dyrket og vedlikeholdt I rpmi-1640 (Invitrogen)media supplert med 10% føtalt bovint serum. Cellene ble dyrket i en fuktet inkubator ved 37°C i en 5% Co2atmosfære.

Opprettelse AV PC3 CDK5dn-cellelinjen

Tap AV CDK5-funksjon ble oppnådd I PC3-cellerved transfeksjon av en dominant negativ konstruksjon som inneholdt En D144nmutasjon, vennlig levert Av Dr Lh Tsai(Harvard Medical School) (18). Protokollen som brukes er beskrevet tidligere (7). Kort sagt ble konstruksjonen subklonert i en toveis tet-vektor, pBI-EGFP (BD Biosciences), som hadde et zeocinresistensgen tilsatt seleksjon (vennligst gitt Av Dr. K. Schuebel, Johns HopkinsUniversity School Of Medicine). pbi-EGFP tom vektor eller pBI-EGFPCDK5dn vektor ble transfisert TIL PC3 celler som inneholdt aTet-Off promoter construct, pTTa (BD Biosciences).

Western blotting

Western blotting ble utført som beskrevet tidligere (19). Ti mikrogram avprotein ble lastet på gelen. Primære antistoffer ble oppløst iblokkeringsbuffer . En fortynning på 1:1000 ble brukt til anti-CDK5( Sigma-Aldrich); anti-vinculin (Millipore, Upstate)ble fortynnet 1: 4000. Sekundære antistoffer ble fortynnet ata 1:4000 fortynning. Normalisering av båndintensiteten ble bærtut med husholderske protein vinculin. Utviklede blotter varhermetisert ved hjelp Av En Microtek-skanner.

sårheling analyse

sårheling analyser ble utført med confluentPC3 kontroll (inneholdende den tomme pbi-EGFP vektor) ELLER PC3 CDK5dncells. En gummi-tippet skrape ble brukt til å skrape av et område avceller. Lys mikroskopiske bilder ble tatt umiddelbart og 24 hafter skraping.

liten molekyl bibliotek screening

jhdl biblioteket har blitt beskrevet tidligere (13,14,17).Lagring og screening av jhdl-forbindelser ble utført som beskrevet tidligere (17).KORT SAGT BLE PC3-kontroll-og CDK5dn-celler sådd i 96-brønnplater (1×103 celler/brønn) og tillatt å feste seg over natten. Then5 µ av legemidler, lagret som lagerløsninger på 200@m inDMSO/H2O, ble lagt til FOR å fullføre RPMI media, slik atceller ble behandlet med en endelig konsentrasjon på 10 µ. Etter 48 timers behandling ble 20 µ MTS-reagens Fra CellTiter 96™ AqueousNon-Radioaktiv Celleproliferasjonsanalyse tilsatt til eachwell i en varighet på 2-4 timer ved 37°C. Plater ble analysert ved hjelp av aSoftMax Pro plate reader (Molekylære Enheter). Proliferasjon av behandlede celler ble sammenlignet med proliferasjon AV DMSO-behandlede PC3control-eller CDK5dn-celler (proliferasjonsindeks). Proliferationindices AV PC3 CDK5dn celler ble sammenlignet med proliferationindices AV PC3 kontrollceller. En PubMed-studie ble utført tilvurdere klinisk bruk av potensielle treff.

MTS-analyser

MTS-analyser ble utført for å måle den antiproliferative effekten av tiloronbehandling. Tilorondihydroklorid (Sigma-Aldrich) ble lagret som en 10 mM lagerløsning i DMSO ved -20°C. Tusen PC3-celler ble belagt i96 – brønnplater som inneholdt 100 µ komplette rpmi-medier. Ved cirka 50% konfluens ble tilorondihydroklorid administrert. Foreksperimenter forbindelsen ble fortynnet i fullstendig rpmi media tilinneholder den ønskede endelige konsentrasjon. ETTER behandling for 72 h(tiloron monoterapi) BLE MTS-reagens tilsatt, og absorpsjon ved490 nm ble bestemt ved Bruk Av En SoftMax Pro plateleser.Proliferasjonsindekser ble beregnet; ubehandlede PC3-kontroll-orCDK5dn-celler (i 103 µ komplette RPMI-medier) ble brukt som acontrol. Studentens t-tester ble utført for å vurdere p-verdier.

Klonogene analyser

Klonogene analyser ble utført for å vurdere langtidsoverlevelse etter tiloronbehandling. Prostatakreftceller varplate i 60 mm retter og lov til å holde seg fast. Ved 50-60% konfluens ble celler behandlet med tiloron i 72 timer. Deretter ble 1×103 celler fra hver tallerken belagt i tre eksemplarer i 60 mm retter og inkubert i komplette RPMI-medier i 12 dager.Kolonier ble løst og farget med en løsning som inneholdt 90% metanol og 10% krystallviolett løsning (2,3% krystallviolett, 0,1% ammoniumoksalat og 20% etylalkohol; Sigma). Kolonier varhermetisert med en dataskanner (Microtek) og talt manuelt.Studentens t-tester ble utført for å vurdere om forskjellene mellom cellelinjene var statistisk signifikante.

3d vekstanalyse

3D vekstanalyse ble utført ved bruk av sameprotocol som beskrevet tidligere (17). Kort sagt ble sfæroider generert avkulturering AV PC3-celler i 16 timer som en hengende dråpe over en fuktigplate i EN CO2-inkubator i komplett rpmi mediacontaining 0.5% metylcellulose. Spheroider ble innebygd i kollagenmatriks (BD Biosciences), behandlet med tilorone, og imagedusing Et Nikon Eclipse Ti mikroskop (Nikon) på behandlingsdagen og seks dager etter behandlingsstart. Spheroid og total (spheroidplus spirer) områder ble målt Med ImageJ. Fold økninger ble beregnet ved å dele sfæroid / totalt areal på dag 6 av thespheroid / totalt areal på dag 0 for hver enkelt sfæroid. For eachcell linje og tidspunkt, fold økninger på fire spheroids varoverlevert. Statistiske analyser ble utført ved Hjelp Av Student ‘ st-tester.

Resultater

Suppresjon AV CDK5-aktivitet

PC3 prostatakreftceller ble valgt for jhdlcompound-skjermen på grunn av deres svært metastatiske potensial og uavhengig av androgen, og dermed ligner aggressiv metastatiskcastratresistent prostatakreft. CDK5-aktivitet ble hemmet avtransfeksjon og seleksjon av en dominant-negativ mutasjon (CDK5144N). DISSE PC3 CDK5dn-cellene hadde et høyere proteinnivå på totalCDK5 sammenlignet MED PC3-kontrollcellene (PC3-celler transfectedwith en tom vektor) (Fig. 1A). Awound healing assay (8) bekreftet AT CDK5 var funksjonelt inaktiv i disse cellene; i motsetning Til PC3control-cellene hadde PC3 CDK5dn-celler ikke muligheten til å invadere det skrapede overflatearealet (Fig.1B).

Biblioteksskjerm for forbindelser som målretter motpc3-celler basert PÅ CDK5-aktivitet

det Ble utført en screening-analyse med høy gjennomstrømming for å velge forbindelser som målretter MOT PC3-celler basert på CDK5-aktivitet. PC3control-og CDK5dn-celler ble behandlet med alle forbindelser av theJHDL ved 10 µ i 48 timer. For å identifisere treff som selektivt målretter motpc3-celler basert PÅ CDK5-uttrykk, valgte vi alle forbindelser som spredningsindeksforholdet (CDK5dn / control)var under 0,5 eller over 1,5 (Fig. 2A).Videre måtte hits hemme celleproliferasjon AV PC3-celler med minst 10%, da vi var spesielt interessert i forbindelser som hindret cellevekst (horisontal og vertikal linje i grafen). Wealso valgte alle forbindelser som hemmet celleproliferasjon ic3-celler med 70% (nederst til venstre i grafen), da vi var interessert i å identifisere potensielle svært effektive antitumoragenter. Totalt ble 41 treff valgt for videre evaluering.

en sekundær skjerm ble utført der valgte treff fra primærskjermen ble lagt til Ved 10 µ i 48 timer Til PC3control og CDK5dn-celler i tre eksemplarer, for å luke ut falske positiveresultater (Fig. 2B). Grenseverdiervar litt mindre strenge enn i primærskjermen; forbindelserble ansett som en hit når forholdet mellom spredningsindekser (CDK5dn / kontroll) var under 0,7 eller over 1,4. Dette resulterte i identifisering av tre forbindelser som selektivt målretter motcdk5-uttrykkende PC3-celler: rutilantin, etakridinlaktat ogcetalkoniumklorid (Fig. 2C).Disse forbindelsene har ikke blitt brukt som antitumormidler, og deres potensielle kliniske bruk som intravenøse antitumormidler synes begrenset (20-23). En annen forbindelse, tilorone analogR9536-DA, var svært effektiv for å hemme begge isogene PC3-cellelinjer (>70% inhibering), men det hemmet spredning Av PC3CDK5dn-celler noe mer effektivt (forhold CDK5dn/kontroll:0.687). Tiloron og dets analoger har antiviral aktivitet, som i det minste delvis virker som interferoninduktorer (24-26) og har vist seg preklinisk og klinisk å ha antitumoraktivitet også (27,28).

Tilorone selektivt mål PC3 cellermed lav CDK5 aktivitet

vi fortsatte våre eksperimenter med fersk dissolvedtilorone dihydrochloride. ETTER 72 timer med tiloronbehandling ved ulike konsentrasjoner ble IC50 etablert ved 8–12Μ I PC3 CDK5dn-celler og 15 µ i PC3 kontrollceller i MTS-analyser(Fig. 3A). Ved 8 µ ble proliferationactivity redusert med henholdsvis 24 og 47% I PC3-kontrollen og CDK5dncells (p=0,001). FOR å vurdere toksisitet av tiloron inormale prostataceller BLE MTS-analyser utført med tiloronebehandling av humane prostatafibroblaster(Fig. 3B). Følsomheten til disse cellene totiloron var lik DEN FOR PC3-kontrollcellene.

tilorons hemmende effekt I PC3-celler ble videre vurdert ved å utføre klonogene analyser (Fig. 3C). PC3 CDK5dn-celler var ogsåbetydelig mer følsomme ENN PC3-kontrollceller til tiloron idenne analysen. Behandling med 10 µ tiloron resulterte i klonogenoverlevelse på 40% I PC3 CDK5dn-celler og 72% I PC3-kontrollceller (p=0,002).

en sfæroidvekstanalyse ble utført for å vurdere 3dtumorvekst og invasjon AV PC3-celler ved tiloronbehandling (Fig. 4). BÅDE PC3-kontroll og PC3CDK5dn-celler hadde sammenlignbare økninger i sfæroidstørrelse over seks dager. Imidlertid hadde total størrelse (størrelsen på sfæroider pluss spirer) en høyere fold økning I PC3 kontrollceller, bekrefter thatubehandlede PC3 CDK5dn celler hadde en redusert invasiv potensial asammenlignet MED PC3 kontrollceller. NÅR tiloron ble administrert ved 5µ, HADDE PC3 kontrollspheroider et lignende vekst-og invasive mønster som ubehandlede PC3 kontrollceller (p=0,59) (Fig . 4B, venstre graf). Når ventilon ble administrert i SAMME konsentrasjon TIL PC3 CDK5dncells, ble det imidlertid observert en signifikant reduksjon i både sfæroidstørrelse og total størrelse (p<0,01), noe som tyder på at tiloron lykkes med å hemme sfæroidvekst og invasjon AV PC3 CDK5dn-celler når de ble administrert ved 5 µ (Fig . 4B, høyre graf). Ved 10 µ hadde begge isogene cellelinjer et redusert invasivt potensial.

Diskusjon

JHDL, et bibliotek med godt karakterisertfarmasøytiske forbindelser, ble utviklet for å lette legemiddelstudier (29). Den omfattende in vivo toksisitet og farmakokinetiske profiler av forbindelser i biblioteket tillater rask etterfølgende utvikling av disse forbindelsene. Flere forbindelser FRA JHDL har blitt avansert til kliniske studier for kreft og andre terapeutiske anvendelser (13,14,16,17,30-32).

i denne studien screenet VI JHDL forforbindelser som differensielt hemmer kreftcellevekst i NÆRVÆR AV CDK5-hemming; tiloron og en tiloronanalog ble identifisert som midler som selektivt retter SEG mot CDK5-mangelfulle PC3prostate kreftceller. Tiloron (Amixin IC) er ansatt kliniski noen land som et oralt aktivt antiviralt middel (25). Tilorone har blitt testet hos menneskerfor behandling av cerebrale gliomer, laryngeal papillomatose ogbrystkreft (28,33,34).Selv om antitumoreffekt ble rapportert, har interessen for tiloron kreftbehandling gått ned. Nylig rapporterte Zhou et alnye tiloronanaloger med forbedret anticanceraktivitet (35). Disse analogene kan være lovende åundersøke, spesielt i kombinasjon med CDK5-hemming.

i tillegg til muligheten for at tiloron kan være lovende i kombinasjon MED CDK5-hemming, foreslår identifikasjonen av tiloron som et middel som selektivt retter seg mot celler med aktiv CDK5 potensielle klasser av legemidler for å potensere EFFEKTEN AV CDK5-hemming. Tiloron har blitt karakterisert som aninterferoninduktor (24). Dette antyder at interferon selv, eller en alternativ interferoninducer som EN TLR-agonist, kan være nyttig i kombinasjon med aCDK5-hemmer. Likevel kan andre mekanismer være involvert. For eksempel er tiloron OGSÅ ET dna-interkalerende middel (24), og man kan forestille seg at det kanmodulere kromatinstruktur og genuttrykk. Andre funksjoner av tiloron, inkludert signalvei og transkripsjonsfaktorinteraksjoner (36,37), kan også være involvert. Videre studier er nødvendig for å løse den nøyaktige virkningsmekanismen ved hvilkentiloron selektivt mål CDK5-negative prostata kreftceller.

Anerkjennelser

forfatterne ønsker Å takke Professorene P. J. Van Diestand E. Van Der Wall for deres støtte og diskusjon Og ProfessorsM.A. Carducci Og J. T. Isaacs for deres levering av laboratoriematerialer. Denne studien ble støttet av Flight Attendant MedicalResearch Institute, NCI R01 CA085567, R01 CA134767, DOD grantW81XWH-06-1-0139 et NCI SPOR grant P50 CA58236. M. D. W. ble støttet Av Dr. Saal van Zwanenbergstichting Og HuygensScholarship-Programmet.