PMC

1detaljerte protokoller og feilsøkingstips for alle aspekter AV GST gene fusion protein expression system er tilgjengelig FRA GE Healthcare i håndbøkene: GST Gene Fusion System, produktnummer 18-1157-58, Og Rekombinant Protein Håndbok, produktnummer 18-1142-75. Håndbøkene er tilgjengelige for kjøp i hard copy eller kan nås SOM PDF på ge Healthcares nettsted.

2bruk AV JM105 eller lignende stamme anbefales for kloning og vedlikehold av vektoren. Stammer AV BL21 og dets derivater, eller en annen proteasemangel, anbefales for maksimal proteinuttrykk. Stammer som mangler cytoplasmatiske proteasegenprodukter som lon, ompT, degp eller htpR kan minimere effekten av proteolytisk nedbrytning av overuttrykt protein hos verten. Ikke bruk en stamme Av E. coli som bærer rec1A-allelet for å forplante pGEX-plasmider, da slettinger eller omarrangementer av plasmid-DNA er rapportert.

3Glutathione Sepharose 4B bulk media brukes i denne rensing protokollen. Dette kromatografimediet er ideelt for screeningsforhold og gir enkel oppskalering. Rensinger utføres enkelt ved hjelp av enten tyngdekraftstrøm eller et lavtrykkskromatografisystem, eller kan brukes i batchrensninger basert på sentrifugering. GSTrap FF affinity kolonner er 1 ml eller 5 ml ferdigpakket kolonner som ogsa er tilgjengelige og kan kobles i serie for oppskalering. Disse kolonnene er til bruk med et væskekromatografisk system, en pumpe eller sprøyte. I tillegg til disse formatene er glutation Sepharose også tilgjengelig i spinnkolonner og 96-brønnplateformater for rask screening AV GST-fusjonsproteinuttrykk og rensingsforhold.

4DFP er et ekstremt farlig nevrotoksin. Følg forholdsreglene fra produsenten og håndter kun det ryddige reagenset i en kjemisk avtrekksdeksel.

5tilsetning av proteasehemmere til lysisbufferen vil bidra til å forhindre proteolytisk nedbrytning av målproteinet under ekstraksjon. Imidlertid bør den nøyaktige cocktailen av proteasehemmere tilsatt lysisbufferen skreddersys til egenskapene til målproteinet. Reduksjonsmidler som 2-ME, DTT eller TCEP i konsentrasjoner på 1-10 mM bør legges til bufferen etter behov. Tilsetning av et ikke-ionisk vaskemiddel, som 1% Triton X-100, kan også legges til bufferen for å hjelpe til med utvinning.

6Following er en screeningsprotokoll for å kontrollere proteinuttrykksnivåer av fusjonsprotein i minikulturer. Tilstedeværelsen av en økning i proteinnivåer ved forventet molekylvekt på EN sds-PAGE gel etter induksjon med IPTG er en god indikasjon på vellykket proteinuttrykk. Etter induksjon skal et fremtredende bånd med forventet molekylvekt (molekylvekt av målprotein + ~ 26 KDa for GST-delen) være synlig. Hvis det er mistanke om at proteinet uttrykkes på et lavt nivå, kan verifisering av riktig uttrykk oppnås ved Bruk Av Western blotting med et antistoff spesifikt for enten målproteinet eller GST. Hvis prøvene ikke umiddelbart blir analysert av SDS-PAGE, kan de lagres over natten ved 4 °C eller ved -20 °C for langtidslagring.

1. Inokulere flere isolerte kolonier i separate 50 ml sentrifugerør inneholdende 10 ml LB supplert med 100 µ/ml ampicillin. Dyrk en overnattingskultur på 37 °C med risting.

2. neste morgen tilsettes 0,5 ml kultur over natten til 4,5 ml PUND med 100 µ/ml ampicillin. Vokse 1 h ved 37 °C.

3. Fjern 1 ml ikke-indusert prøve. Sentrifuge og fjerne supernatant. Frys eller lagre pa is til du er klar til a kjore SDS-SIDEN.

4. Legg IPTG til en endelig konsentrasjon på 1 mM og vokse for ytterligere 2-3 timer.

5. Fjern 1 ml indusert prøve. Sentrifuge og fjerne supernatant. Frys eller lagre pa is til du er klar til a kjore SDS-SIDEN.

6. Resuspend cellepellets i 200 µ SDS-SIDE prøvebuffer; varme 3-5 min ved 90 °C.

7. Analyser 5-10 µ ved HJELP AV SDS-SIDE etterfulgt Av Coomassie blå flekker (eller 1-2 µ For Western blot).

7 samples dyrket i mini-kulturer kan også brukes til å evaluere oppløseligheten av et bestemt fusjonsprotein (se Note 6 for mini-culture expression protocol). På slutten av induksjonsperioden høstes cellene ved sentrifugering. Resuspend pellet i 200 µ av kalde PBS. Lys cellene ved hjelp av sonikering; hold prøven på is. Lagre en liten aliquot av lysatet for analyse av SDS-SIDEN. Sentrifuger den lyserte prøven i 15 minutter. Fjern supernatanten til et separat rør. Resuspend pelleten i 200 µ PBS. Analyser noe av det rå lysatet, supernatanten og den resuspenderte pellet ved SDS-PAGE eller Western blotting. Hvis prøven observeres i både lysat-og supernatantfraksjonen, er prøven tilstrekkelig løselig. Hvis prøven er tilstede primært i lysatet og resuspendert pellet, er prøven mest sannsynlig i okklusjonsorganer. I tilfeller der proteinet befinner seg i inklusjonsorganer, utforsk ulike uttrykksbetingelser for å skifte uttrykk til en løselig form (Se Note 8).

8 hvis fusjonsproteinet først og fremst uttrykkes i inklusjonsorganer (f. eks. > 80% uoppløselig), kan ulike strategier benyttes for å forbedre oppløseligheten. Ofte er induksjon ved lavere temperatur (15-25 °C) effektiv for å skifte uttrykk fra inklusjonsorganer til løselig fraksjon. Celler indusert ved denne lavere temperaturen vil vokse saktere og vil kreve over natten induksjonsperioder. Bruk av alternative vertsstammer eller modifikasjoner på plasmidkonstruksjonen kan være nødvendig i noen tilfeller. Hvis fusjonsproteinet forblir primært i inklusjonsorganer selv etter forsøk på å oppnå løselig protein, kan Det være verdt å skalere opp produksjonen Av E. coli og rense nok protein fra den lille mengden av løselig protein som er tilgjengelig. I noen tilfeller bør andre fusjonsproteinetiketter utforskes.

9 lavproteinuttrykksnivåer kan være et resultat av sjelden kodonbruk. I dette tilfellet kan bytte til en annen stamme Av E. coli som inneholder ekstra transkripsjoner for sjeldne kodon tRNA, forbedre proteinproduksjonen betydelig. Ulike medieformuleringer eller tilsetning av opptil 2% glukose kan også forbedre uttrykket (13, 14). Hvis det er mistanke om at det uttrykte proteinet er giftig for cellene (vanligvis vil de slutte å vokse etter induksjon med IPTG), prøv å indusere på et senere tidspunkt i kortere tid. Redusere IPTG-konsentrasjonen er et annet alternativ som bør utforskes.

10overvåk cellevekst ved å lese den optiske tettheten ved 600 nm (A600). En overnattingskultur bør nå En A600 ~1-1. 2. Celler bør induseres i en tidlig fase av den logaritmiske vekstkurven For E. coli, A600 ~ 0,5 til 0,7. Ved 37 °C vil det ta omtrent 2 timer for kulturer å nå et tidlig loggstadium av vekst. Hvis celler dyrkes ved lavere temperatur, må inkubasjonstiden økes, siden cellene vil vokse sakte ved lavere temperaturer. Generelt vil det største utbyttet av fusjonsprotein oppnås når cellene induseres Ved A600 = ~ 0.5. Etter induksjon med IPTG er en generell retningslinje for inkubasjonstid som følger: 3 h ved 37 hryvnias C, 5 h ved 30 hryvnias C og over natten for 25 hryvnias C Eller lavere. Høste cellene før metning, A600 ~ 1.0-1.2.

11 for å sikre tilstrekkelig lufting bør kolber bare fylles til 20-30% av kapasiteten.

12 det er viktig at ingen serinproteasehemmere er tilstede i prøven før spaltning med trombin eller faktor Xa. Følgende proteasehemmere må fjernes før trombin-eller faktor xa-spaltning: AEBSF, APMSF, antitrombin III, antipain, α1-antitrypsin, aprotinin, kymostatin, hirudin, leupeptin og PMSF. I tillegg er pefabloc th benzamidin spesifikk for trombin, Og Pefabloc FXa er spesifikk for faktor Xa. Følgende proteasehemmere bør unngås med PreScission Protease: 100 Mm ZnCl2, 100 µ chymostatin og 4 mM Pefabloc.

13det finnes en rekke alternative metoder for påvisning AV gst-fusjonsproteiner. For proteiner som uttrykker seg godt på høyt nivå, er den enkleste metoden for å overvåke rensingen via SDS-SIDE geler farget Med Coomassie blå eller sølv flekk. Et alternativ for proteiner som uttrykker seg ved lave nivåer, er Å bruke Western blotting ved hjelp av et antistoff rettet mot ENTEN GST eller målproteinet. Et alternativ for småskala uttrykk er å overvåke tilstedeværelsen AV GST med EN ELISA eller CDNB enzymanalyse.

14lagre en liten mengde proteinprøve fra hvert trinn i rensingen, inkludert lysis, supernatant, pellet, ubundne fraksjoner fra prøvebelastning, vasketrinn og elusjonstrinn som skal analyseres AV Sds-PAGE eller Western blotting. Etter at alle prøver har blitt analysert og samlet, kast bort uønskede fraksjoner.

15gst proteiner kan også renses ved hjelp av en batch rensemetode. En batch rensemetode er rask, enkel, og krever lite utstyr; det resulterende proteinet kan imidlertid inneholde flere urenheter og ha et lavere utbytte enn en kromatografibasert rensing. Batch purifications er best utnyttet ved screening rensing forhold. Batchrensingen som er skissert nedenfor, utføres vanligvis ved romtemperatur. For å minimere risikoen for proteolytisk degradering kan prosedyren utføres ved 4 °C ved å øke inkubasjonstiden 2 til 4 ganger.

1. Lyse celler og få løselig fusjonsprotein (Se Note 8 og 21 hvis prøven er i inklusjons organer).

2. Tilsett 2 ml 50% slurry glutation Sepharose bulkmatrise (1 ml sengevolum) per 100 ml bakteriell lysat supernatant. Inkuber 30 min ved romtemperatur med mild omrøring.

3. Sentrifuge 500 × g i 5 min. Fjern supernatanten og lagre for analyse AV SDS-SIDEN for a bestemme bindingseffektiviteten.

4. Vask harpiksen med 10 sengevolumer PBS. Forsiktig resuspendere, og deretter sentrifuge 500 × g i 5 min. Fjern supernatanten. Gjenta vask og sentrifugering trinn for totalt 3 vasker av 10 seng volumer hver.

5. Eluder fusjonsproteinet ved å resuspendere harpiksen med 1.0 ml glutation elueringsbuffer per ml sengevolum. Inkuber 10 min ved romtemperatur. Sentrifuge 500 × g i 5 min. Overfør fusjonsproteinholdig supernatant til et separat rør. Gjenta eluering og oppsamlingstrinn totalt 3 ganger. Supernatantene kan samles eller analyseres separat av SDS-PAGE for å overvåke proteininnholdet (Se Note 12).

16a sengevolum er lik halvparten av 50% slurry av glutation Sepharose 4B brukt til rensing. For å forberede en 50% slurry av glutation Sepharose (den leveres som ~ 75% slurry): Bestem sengevolumet som kreves for renseskalaen. Resuspend glutation Sepharose 4B. for hver ml sengevolum som kreves, pipet 1,33 ml av 75% slurry til en passende størrelse sentrifugerør. Sentrifuge ved 500 × g i 5 min. Dekanter super. Vask MED 10 sengevolumer (10 ml per 1,33 ml original slurry) AV PBS ved forsiktig å snu røret flere ganger for å blande, deretter sentrifuge 500 × g i 5 min. Dekanter super. Unnlatelse av å fjerne etanoloppbevaringsløsningen kan forstyrre påfølgende bindingstrinn. Tilsett 1 ml PBS for hver 1,33 ml av den opprinnelige slurryen. Dette resulterer i en 50% slurry.

17glutathione Sepharose har en annonsert minimumsbindingskapasitet på 8 mg / ml. En 20 ml kolonne skal være tilstrekkelig til å rense protein fra 3 × 600 ml e. coli kulturer som inneholder ~ 20-40 mg fusjonsprotein per kultur. Både mengden harpiks som brukes og kolonnestørrelsen kan skaleres opp eller ned avhengig av mengden protein som skal renses.

18 resuspend pellet ved hjelp av 25-50 µ vaskebuffer per ml originalkultur.

19cell avbrudd er fullført når suspensjonen delvis klarner og slår en litt mørkere farge. Unngå skumming under sonikering, da dette kan føre til denaturering av fusjonsproteinet. Unngå oversonikering, da dette kan føre til samrensing av verts-e. coli-proteiner sammen med gst-fusjonsproteinet. Høy viskositet på grunn av frigjøring av nukleinsyrer under sonikering kan reduseres ved å tilsette DNase eller benzoase til lysisbufferen. Lysozym opp til en konsentrasjon på 0.2 mg / ml kan tilsettes som et hjelpemiddel til cellelyse. Et alternativ til sonikering er bruken av kommersielt tilgjengelige celleutvinningsformuleringer. Disse produktene kan imidlertid inneholde proprietære komponenter som forstyrrer nedstrøms applikasjoner.

20 hvis forsøk på å skifte uttrykk fra inkluderingslegemer til den oppløselige fraksjonen mislykkes, kan uoppløselige gst-fusjonsproteiner noen ganger renses i nærvær av denaturanter som urea, etterfulgt av refolding. Solubilisering ved bruk av vaskemidler som sarkosyl (N-laurylsarosin) har også vært vellykket ansatt (15, 16). Selv om følgende protokoll har blitt brukt med hell for å denaturere OG re-natur GST fusjonsproteiner, er hver fusjonsproteinkonstruksjon unik og de nøyaktige denaturerings-og re-natureringsforholdene må bestemmes empirisk. Vanlige denaturanter som har vært vellykket ansatt inkluderer guanidin HCl, urea, Tween 20, CTAB og SDS (17, 18). Denaturantene må da fjernes helt for å tillate riktig refolding av proteinet. Forhold som bør optimaliseres for å lette refolding inkluderer: type denaturant, pH, tilstedeværelse av reduksjonsmiddel, hastighet av denaturant fjerning og proteinkonsentrasjon. Når proteinet har blitt re-natured, kontroller at proteinet har gjenvunnet sin opprinnelige konformasjon og funksjon og fjern eventuelle feilfoldede proteiner.

1. pre-equilibrate glutation Sepharose kolonne; sonicate pelleted e. coli celler, og skille lysat supernatant og pellets fraksjoner ved sentrifugering (se 3.3 Affinity rensing AV GST fusion protein trinn 1-8). Resuspend lysatpellet som inkluderer inklusjonslegemene, i 15 ml vaskebuffer. Sentrifuge 20 min ved 48 000 × g (4 °C). Dekanter supernatanten og resuspend den vasket pelleten i 12 ml U-buffer (resuspend i 20 µ U-buffer per ml opprinnelig kultur). Inkuber 2 timer på is.

2. Sentrifuge 20 min ved 48 000 × g (4 °C). Overfør supernatanten som inneholder det denaturerte fusjonsproteinet til et rent sentrifugerør.

3. Tilsett Triton X-100 til supernatanten til en endelig konsentrasjon på 1%.

4. Dialyze prøven I PBS / glyserol for 2-3 h. volumet av dialysebufferen bør være minst 20 ganger prøvevolumet.

5. Dialysere prøven over natten versus pbs med proteasehemmere ved hjelp av et buffervolum som er > 100 ganger prøvevolumet.

6. Fjern prøven fra dialyse og sentrifuge 20 min ved 4 000 × .

7. Ekstrahert og re-natured protein fra inkluderingsorganene kan nå brukes på glutation Sepharose kolonner og renset.

Løsninger:

vaskebuffer: 50 mM Tris, 5 mM EDTA, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatin, 0,15 mm PMSF pH 8,0

U-buffer: 5 M urea, 50 mM Tris, 5 mM EDTA,5 mM, 2-MEG, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatin, 0,15 mM PMSF, 1 mM DFP pH 8,0

PBS/glyserol: 1X PBS, 20% glyserol, 1% Triton X-100, 5 mM, 2-ME, 5 mM EDTA, 5 mM, 2 – MEG, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatin, 0,15 mM PMSF, 1 mM DFP pH 7.4

21Use av en peristaltic pumpe anbefales å jevnt kontroll flow priser. Hvis kompresjon av harpiksen oppstår, er trykket for høyt og strømningshastigheten skal reduseres.

22bindingskinetikken mellom glutation og GST er relativt langsom. Derfor er det viktig å bruke lave strømningshastigheter for å oppnå maksimal bindingskapasitet, f. eks. 0,1 ml / min for en 2,5 cm Id-kolonne. Bruk av strømningshastigheter som er for raske, kan redusere mengden bundet fusjonsprotein på grunn av den langsomme kinetikken til forening. Vaske-og elueringstrinn kan utføres med raskere strømningshastigheter for å spare tid (henholdsvis 1,5 ml/min og 0,3 ml/min). For store volumprøver utføres bindingen mest hensiktsmessig over natten, med justeringer av strømningshastigheter slik at kolonnen ikke går tørr.

23analyse av de ubundne fraksjonene vil indikere om fusjonsproteinet er bindende eller ikke. Hvis proteinet ikke oppdages i tidlige fraksjoner, men vises i senere fraksjoner, indikerer det at kolonnekapasiteten er overskredet. Reduksjon i proteinbelastning eller økning i kolonnestørrelse vil lindre denne tilstanden.

24 hvis fusjonsproteinet binder seg dårlig til glutation-Sepharosen, er det flere alternativer for å prøve å øke bindingseffektiviteten. Prøv en mildere lysis metode. Hvis metoden som brukes er for hard, kan proteinet bli denaturert og derfor ikke i stand til å binde seg til kolonnen. Også, hvis re-naturing proteinet fra inkludering organer, være sikker på at alle denaturanter har blitt fjernet fra bufferen, enten gjennom uttømmende dialyse eller anvendelse av prøven til en avsaltning kolonne, før påføring til glutation kolonnen. Fjern etanoloppbevaringsløsningen fra glutation Sepharose; reduser kolonnen med fersk glutationbuffer etterfulgt av en vask med PBS umiddelbart før prøveinnlasting. Øk mengden harpiks og / eller reduser strømningshastigheten som brukes til å laste prøven. Prøv å legge 1-20 mM DTT til prøven. Hvis et problem vedvarer, rengjør du kolonnen i henhold til produsentens anbefaling. Hvis bindingen fortsatt ikke gjenopprettes, prøv å bruke fersk harpiks.

25utbyttet av fusjonsprotein kan også estimeres ved å måle absorbans ved 280 nm (A280). Utryddelseskoeffisienten for GST-delen alene er ~ 1,5, dvs. 1,00 A280 = ~ 0.6 mg/ml protein, selv om utryddelseskoeffisienten for fusjonsproteinet vil avhenge delvis av absorbansegenskapene til målproteinet.

26 hvis det er et problem å eluere proteinet fra glutation Sepharose-kolonnen, prøv å redusere strømningshastigheten og øke volumet av elueringsbuffer som brukes. Pass på å bruke fersk redusert glutationbuffer (gjør den dagen den skal brukes). Øk konsentrasjonen av glutation opp til 40 mM og / eller øk ph i bufferen til pH 8,0–9,0. Legg 1-20 mM DTT (eller annet reduksjonsmiddel) til bufferen. Tilsetning av et ikke-ionisk vaskemiddel kan også forbedre oppløseligheten og minimere eventuell aggregering som kan forekomme.

27forurensning av det rensede fusjonsproteinet med e. coli-vertscelleproteiner er en indikasjon på at sonikering har vært for alvorlig. Hvis degraderte fragmenter av fusjonsproteinet er tilstede, prøv å legge til ekstra proteasehemmere til lysisbufferen. Hold alle prøver, buffere og oppsamlingsrør kalde for å minimere proteolyse. Hvis nedbrytning oppstår under proteinuttrykk, prøv å indusere prøven sent (~0.8 OD600) og reduser lengden på induksjonsperioden. Bytte til en alternativ vertsstamme kan også hjelpe.

28et alternativ til fordøyelse i oppløsning er proteasespaltning av fusjonsprotein mens det er bundet til glutation-Sepharosematrisen. Fusjonsproteinet ekstraheres og lastes på glutation Sepharose etterfulgt av vasking MED PBS (se Affinitetsrensing AV GST fusion protein, trinn 1-11). I stedet for å eluere proteinet med glutationbuffer, lastes EN pbs-løsning som inneholder enzymet på kolonnen og inkuberes i flere timer ved romtemperatur(4 °C For PreScission protease). Det spaltede proteinet vaskes deretter ut av kolonnen med flere kolonnevolumer AV PBS. Restfusjonsprotein og gst-delen kan fjernes fra kolonnen ved å vaske kolonnen med redusert glutationbuffer. Mengden enzym og inkubasjonstid må bestemmes empirisk for hvert fusjonsprotein. Analyser alle prøver av SDS-SIDE for å bestemme spaltningseffektivitet og proteinrenhet.

29i en batchmodus proteasespaltning, legg til en empirisk bestemt mengde enzym til fusjonsproteinet bundet til harpiksen (se Note 15 a–d). Bruk 1 ml PBS-inneholdende enzym per ml sengevolum. Inkuber ved romtemperatur i flere timer med mild omrøring. Sentrifuge 500 × g i 5 min for å sedimentere harpiksen. Fjern super som inneholder målet protein til et eget rør. Vask glutation Sepharose med PBS opptil 3 ganger for å gjenopprette spaltet fusjonsprotein. Inkuber harpiksen med glutationbuffer for å fjerne GST og gjenværende fusjonsprotein. Bruk 1 ml glutationbuffer per ml harpiks. Sentrifuge 500 × g og utvinn eluert GST. Gjenta opptil 3 ganger. Analyser prøver av SDS-SIDE.

30 hvis du bruker trombinprotease, kan fordøyelsen utføres i glutationbufferen som brukes til å eluere proteinet fra kolonnen. Hvis du bruker faktor Xa, anbefales det å dialyse proteinet i Enten En Tris buffer eller PBS buffer før fordøyelsen; glutation tilstede i elueringsbufferen kan forstyrre disulfidbroene tilstede i faktor Xa som fører til ineffektiv fordøyelse av fusjonsprotein. En empirisk bestemmelse av fordøyelsesforhold for hvert fusjonsprotein må bestemmes i et pilotfordøyelsesforsøk. En praktisk metode er å fordøye 100 µ fusjonsprotein over en rekke enzym-til-substrat-forhold og variere inkubasjonstiden. Typiske inkubasjonstider varierer fra 2 til 8 timer. Anbefalte enzym-til-substrat-forhold for trombin er 1:100, 1:350, 1:1000, og 1:3000 (enheter av enzym per µ fusjonsprotein), og for faktor Xa er 1:10, 1:25, 1:50, 1:100, 1:300 (µ enzym per µ fusjonsprotein). På ønskede tidspunkter, fjern 2 µ protein og stopp fordøyelsen ved å legge prøveekvoten til kokende sds prøvebuffer. Analyser prøvene ved SDS-SIDEN for å bestemme de optimale spaltningsforholdene. I tillegg til enzym-til-substratforhold og tid, bør du vurdere å endre bufferforhold, for eksempel å øke Eller redusere nacl-konsentrasjonen eller legge Til Ca2 + til bufferen (se Note 31 for feilsøkingstips).

31 hvis det observeres flere bånd på SDS-SIDEN for målproteinet etter fordøyelsen, må du kontrollere målproteinsekvensen for potensielle sekundære proteasegjenkjenningssteder. Hvis sekundære spalting områder eksisterer, re-klone i en annen vektor. Hvis det ikke observeres spaltning, kontroller DNA-sekvensen for å verifisere tilstedeværelsen og integriteten til det forventede proteasespaltningsstedet. Pass på at proteasehemmere er fjernet helt fra bufferen. Legg til mer enzym og / eller øk inkubasjonstiden til over natten. Hvis fordøyelsen forblir ufullstendig ved de høyeste enzym-til-substrat-forholdene og lengste tidspunkter, bør du vurdere å reengineere proteasespaltningsstedet for å inkludere flere glysiner mellom GST-delen og målproteinet for å redusere sannsynligheten for at sterisk hindring forstyrrer spaltningen (19, 20).

32 hvis hemming av enzymet etter fordøyelsen er fullført ved bruk av serinproteasehemmere er uønsket, kan prøven påføres En HiTrap benzamidinkolonne for å fjerne enzymet fra prøven.

33 hvis prøven skal re-kromatograferes på glutation Sepharose-kolonnen for å fjerne GST og eventuelt ufordøyd fusjonsprotein, er det kritisk at den reduserte glutation fjernes helt fra prøven. Glutation balanserer veldig sakte over dialysemembraner; derfor hvis dialyserør med EN MWCO <12,000 brukes, kan 3 eller flere endringer av buffer være nødvendig for fullstendig fjerning. Økt dialysetid (over natten) og et større volum buffer kan også være nødvendig for store prøvevolumer.

34den samme glutation Sepharose kolonnen kan brukes til både innledende isolering av fusjonsproteinet og for repurification etter enzymatisk spaltning. Det anbefales å dedikere en enkelt kolonne til en individuell proteinkonstruksjon for å unngå potensiell krysskontaminering av forskjellige rekombinante proteiner. Kolonner kan gjenbrukes flere ganger. Hvis bindingseffektiviteten reduseres over tid, rengjør kolonnen i henhold til produsentens anbefalinger. Hvis bindingsaktivitet ikke gjenopprettes, skal en ny kolonne brukes.

35maksimal binding oppstår hvis kolonnen er fullstendig redusert; men hvis glutation Sepharose kolonnen har blitt vasket mindre enn 48 h før dette trinnet, kan dette trinnet hoppes over.

36målproteinet vil være i den ubundne fraksjonen, OG GST og ethvert ikke-spaltet fusjonsprotein vil binde seg til kolonnen.

37små prøvevolumer anbefales for god oppløsning av målprotein versus andre forurensninger. Hvis det ikke er mulig å konsentrere prøven i et lite volum, kan flere injeksjoner av prøven utføres.