PMC

CPV – 2 er den viktigste etiologiske agent for viral gastroenteritt hos hunder. Det er medlem Av Parvoviridae familien, som tilhører theprotoparvovirus slekten Og Protoparvovirus type 1 arter. Det er et ikke-innhyllet virus med et enkeltstrenget DNA-genom, som koder for to kapsidproteiner, VP1 og VP2, som kreves for montering og pakking av virusgenomet, så vel SOM FOR NS1 og NS2 ikke-strukturelle proteiner, somaid i kontroll AV DNA-replikasjon, montering og regulering av generuttrykk .

I løpet AV de siste årene HAR CPV – 2 utviklet nye antigenvarianter. I 1980 ble CPV-2 original stamme erstattet av varianten betegnet type 2a (CPV-2a), I 1984 ble CPV-2b identifisert, OG I 2001 ble CPV-2C oppdaget og rapportert I Italia. Den siste varianten har også blitt identifiserti Asia, Afrika og Amerika. På grunn av eksistensen av flere antigenvarianter FOR CPV-2, kan de kliniske tegnene variere sterkt .Deretter veterinærer har mindre sikkerhet ved utstedelse av presuntive diagnose, og vanligvis noen laboratorietester er nødvendig for åbekreft deres diagnose; selv om flere teknikker har blitt utviklet i forskningslaboratorier, som hemagglutinasjonsanalyser, immunfluorescens, ELISA,PCR, immunokromatografitest og cellekultur (blant annet), faktisk teknikker med størst tilgjengelighet innen kliniske laboratorier på veterinærsykehusbare er immunokromatografitesten OG PCR, men i forskningen om sensitiviteten og spesifisiteten til disse prosedyrene, er rapportene kontroversielle.Videre, hos pasienter med varierende grad av sykdom alvorlighetsgrad, følsomhet og spesifisitet av disse teknikkene har ikke blitt grundig studert.

målet med denne studien er å rapportere fordeler og ulemper som tilbys av immunokromatografitest og PCR for diagnose av pasienter som presenterer et bredt mangfold av kliniske tegn FOR CPV-2.

denne studien ble utført i henhold til retningslinjene For Eksperimentell Dyreforskning Meksikanske Offisielle Norm NOM-062-ZOO-1999.

Hunder med klinisk enteritt innlagt På Veterinærhospitalet for Små Dyr Ved Universidad Aut@noma De Estado De Mé, ble screenet for denne studien og valgt ut fra testet positiv ELLER negativ CPV-2 ved bruk av nestet PCR (nPCR). Som et resultat ble 45 hunder som testet positivt valgt, og 5 negativytestede hunder ble inkludert som kontroller. De 50 hundene ble klinisk undersøkt av tre veterinærer samtidig for å oppnå følsomhet for klinisk diagnose. Eachveterinarian utstedte sin presumptive diagnose på en diskret måte, ved hjelp av problemorientert veterinærmedisinsk rekord (POVMR) som deres diagnostiske verktøy.

deretter ble fekale prøver av alle hunder analysert GJENNOM PCR-og immunokromatografitest, mens blodprøver ble brukt til å utføre en fullstendig blodtelling.

nPCR anses som en svært pålitelig og sensitiv teknikk for å identifisere CPV – 2 viruspartikler, og derfor var følsomheten til de brukte testene i denne studien korrelert med de som ble oppnådd tidligere fra nPCR, for CPV-2diagnose.

avføringsprøver Av Hunder ble tatt ved bruk av rektale vattpinner, som ble suspendert i nuklease-fritt vann og 200 µ av homogenatene, og ble brukt forDNA-ekstraksjon. Prosedyren ble utført Ved Bruk Av qiaamp® DNA Krakk DNA extraction kit (QIAGEN, Mainz, Tyskland), i henhold til produsentens instruksjoner. AllDNA-prøver ble kvantifisert ved hjelp Av Et Q5000 Quawell spektrofotometer (Quawell Technology, Inc., San Jose, CA, Usa). 100 ng DNA av hver prøveble brukt TIL PCR-reaksjoner med 50 µ av sluttvolum. Tidligere ble et par primere designet i vårt laboratorium for å forsterke et 275 bp-fragment, ParvoInt2FB (5′-TCAAGCAGATGGTGATCCAAG-3′) og ParvoInt2CR (5′-GGTACATTATTTAATGCAGTTA–3′) som ligger ved nukleotider 1,107–1,130 og 1,360-1,382 AV vp2-genet (GenBankaccession nummer fj0051962c).

PCR-reaksjoner ble utført ved bruk av 2 µ av hver primer (200 nM), 12,5 µ Av GoTaq® Green Master Mix (Promega, Madison,WI, Usa) som inneholdt DNA-polymerase, reaksjonsbuffer (pH 8,5) og 400 µ av hvert nukleotid (dATP, dGTP, Dctp og dTTP); 3 mM MgCl2.og 28.5 hryvnl av nukleasefritt vann. Alle reaksjoner ble utført under følgende forsterkningsbetingelser; 1 syklus ved 94°C i 5 min forførlig denaturering, etterfulgt av 35 sykluser ved 94°C i 30 sek, 52°C i 1 min, 72°C i 1 min og en endelig forlengelsessyklus ved 72°C i 5 min.

nPCR ble først gjort for å forsterke et fragment av 1740 bp ved Hjelp Av ParvoExt1f (5′-ATGAGTGATGGAGCAGTTCA-3′) og ParvoExt3R (5′-AGGTGCTAGTTGAGATTTTCATATAC-3′) primere,og ble utformet ved hjelp av nukleotidsekvensene 1-20 og 1712–1740 fra genet VP2 for canine parvovirus (GenBank tiltredelsesnummer fj0051962c). Reaksjonen ble standardisert til et endelig volum på 50 µ.

reaksjonen blanding inneholdt 1 µl av GoTaq® Flexi DNA-Polymerase 5 U/µl (Promega), 5 µl av GoTaq® Flexi buffer 5XGreen, 3 µl av MgCl2 25 mM, 4 µl dNTP er 200 µM, 2 µl av primere, 10 µl DNA med en endelig konsentrasjon på 100 ng og 23 µl av nuclease gratis vann. Reaksjonen ble utførtunder følgende forsterkningsbetingelser: 1 syklus ved 94°C i 5 min, etterfulgt av 35 sykluser ved 94 hryvnias C i 30 sek, 50°C i 45 sek, 72°C i 1 min og 1 syklus ved72°C i 5 min. Etterpå ble 1 µ av produktet av denne reaksjonen brukt SOM DNA-mal for hekkeprosedyren, og primere og forsterkningsbetingelser var de samme for 275 bp-fragment.

Alle forsterkningsproduktene ble identifisert ved horisontal elektroforese i 2% agarosegeler farget med 0,5 µ / ml av etidiumbromid og visualisert med EN UV-transilluminator.

FOR analyse av immunokromatografitest for hundeparvovirus (CPV Ag), ANIGEN® – settet (Bionote Inc., Gyeonggi-do, Korea) ble benyttet. Hver test ble utført etter produsentens instruksjoner.

Blodprøver ble tatt fra jugularvenen ved bruk av vacutainer-rør med EDTA som antikoagulant. Komplett blodcelletall (CBC)ble utført ved bruk av anautomert celleteller (QBC vet-IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, MEG, Usa). Blodfilmene ble farget Med Wright-Giemsa og undersøkt under et fotonikmikroskop. Leukopeni ble vurdert når et totalt CBC-antall var mindre enn 6 × 103 /µ

Resultatanalyse ble utført ved bruk av en matrise for kodede variabler , og beredskapstabeller ble opprettet for å bestemme de diagnostiske testegenskapene . Videre Ble Kappa-statistikken bestemt for å estimere avtalen mellom de tre brukte testene og nPCR. Kappa-verdien ble karakterisert i henhold Til Kantere og kolleger i 2015 hvor kappa-verdien 1 indikerer absolutt avtale, mens en verdi på 0 indikerer at avtalen oppstår på grunn av tilfeldighet. Generelt Indikerer Kappa-verdier høyere enn 0,6 et godt avtalenivå; analysen ble utført ved hjelp AV statistikkpakken SPSS Ver. 22.0 (IBM, Inc., Armonk, NY, Usa).

Nitti ett punkt en (91,1) % av positive hunder for CPV-2 av nPCR var ren avlet; 95.5% av pasientene var mellom to og åtte måneder gamle, og 4,5% var eldreenn ett år. Når det gjelder vaksinasjonsstatus, ble 40% vaksinert minst en gang for å forhindre cpv-2-infeksjon.

Hyppigheten av kliniske symptomer hos disse hundene var som følger: 44,4% viste oppkast og diare; 20% hadde feber, oppkast og diare(katarral eller hemorragisk); 17,7% viste bare diare; 8,8% viste bare oppkast; og 4,4% hadde diare og feber, og 4,4% viste oppkast og feber.Leukopeni ble observert hos 48,8% av hundene (Tabell 1).

ved hjelp av klinisk undersøkelse diagnostiserte veterinærer kun 57,8% av pasientene positive TIL CPV – 2 og 100% av de negative hundene. følsomhetsverdien for klinisk diagnose ble derfor estimert til 57,7% (CI0. 95 42,2-72–, og den observerte spesifisiteten var 100% (CI0.95 46,2–98,8).

når det Gjelder laboratorieprøvediagnose, av 100% av hundene som resulterte positivt gjennom nPCR, var bare 30/45 av disse pasientene cpv-2 positive gjennomimmunokromatografitest, mens de fem kontrollpasientene som testet negativt for CPV-2 ble korrekt diagnostisert. Derfor viste denne teknikken en sensitivitetav 66,6% (CI0.95 50,9–79,5), og den observerte spesifisiteten var 100% (CI0.95 46,2–98,8).

VED BRUK AV PCR-teknikk var 36/45 pasienter positive TIL CPV-2, og de fem kontrollpasientene ble bekreftet negative gjennom hele nPCR. DERMED VISTE PCR asensitivitet på 80% (CI0. 95 63,1-87,7–og en spesifisitet på 100% (CI0.95 67,8-99,1) (Fig. 1).

Enighet mellom de tre teknikkene er demonstrert gjennom Kappa-verdien (Tabell 2).

Gastroenteritt forårsaket AV CPV-2 regnes som en av de viktigste virussykdommene som påvirker hunder. Selv om kliniske tegn på parvovirusinfeksjon hos hund kan variere, var de vanligste tegnene som ble rapportert: anoreksi, depresjon, letargi, feber, mucoid og hemoragisk diare og leukopeni ; i subkliniske tilfeller kan noen av disse tegnene være eller ikke være tilstede .

under klinisk undersøkelse ble det observert variabilitet i kliniske manifestasjoner av infeksjon. Bare 20% av de studerte hundene presenterte typiske tegn som vanligbeskrevet i litteraturen. Klinisk variasjon for denne sykdommen er rapportert tidligere, og noen forfattere har diskutert faktorer som alder, immunstatus, eksponeringsvei, viral dose, virulens av stammer og samtidig infeksjon med andre smittestoffer som mulige årsaker . Dette kompliserer å oppnå en nøyaktig diagnose AV CPV-2 når veterinærer stole utelukkende på deres kliniske undersøkelse. Derfor, angående vårundersøkelse utelukkende basert på denne prosedyren, vil 42,2% av hundene ha en falsk-negativ cpv-2-diagnose.Gjennom hundens medisinske journaler i denne studien observerte vi atveterinærer utelukket muligheten for infeksjon, hovedsakelig fordi hundene ikke viste de klassiske kliniske tegnene som er beskrevet i litteraturen, hadbeen vaksinert mot CPV-2 og/eller var voksne. Imidlertid viste de fleste hundene i vår studie atypiske tegn. Derfor tror vi at subkliniske infeksjoner AV CPV-2 er vanligere, og veterinærer, som må avgjøre om de skal bruke flere diagnostiske tester med høy følsomhet og spesifisitet, bør vurdere disse funnene seriøst.

i denne studien hadde 40% av PASIENTENE som var POSITIVE TIL CVP-2 tidligere blitt immunisert. Det er velkjent AT PCR-teknikk er svært følsom, og det oppdagervaksine virale partikler i avføring fra nylig vaksinerte pasienter; studier indikerer at det er mulig å oppnå falske positive resultater fra dag 3 til 10post-vaksinasjon med en modifisert levende CPV-vaksine . Følgelig, for å utføredenne studien ble pasienter med vaksinasjonshistorie de siste 15 dagene ekskludert. I tillegg ble prøver fra vaksinerte hunder positive TIL CPV-2 sekvensert,og i alle studerte tilfeller ble genovariant CPV-2C identifisert (data viser ikke), noe som innebærer at hunder ble infisert med felt CPV-2C, og visste at INGEN CPV-2CVACCIN er tilgjengelig ennå i Mexico. Videre rapporterte Pedroza Og kolleger I Mexico at DEN vanligste antigenvarianten hos smittede hunder var CPV-2c .

på den annen side vurderer mange veterinærer tilstedeværelsen av leukopeni, en støttende faktor for cpv-2-diagnose. Men vi observerte at bare 48.8% (22/45) av de studerte hundene presenterte leukopeni under evalueringen, noe som er i samsvar med andre rapporter som indikerte at rundt 50% av hundene ikke viser hematologicalterations ved evalueringstidspunktet . DERFOR ER EN CBC et verdifullt verktøy som kan gi informasjon omsykdom alvorlighetsgrad, noe som tyder på en prognose og bestemme responsen på behandlingen. Leukopeni bør imidlertid ikke betraktes som et diagnostisk verktøy for CPV-2,fordi det ikke gir bevis for virustilstedeværelse.

Ulike teknikker for viral identifikasjon brukes til den endelige bekreftelsen AV infeksjon AV CPV-2, for eksempel raske tester basert på immunokromatografier mye brukt av klinikere, fordi prosedyren er enkel, rask og tilgjengelig. I tillegg krever det ikke prøvepreparering eller sending til en spesialisertlaboratorium for analyse. Den varierende følsomheten til denne testen er dens ulempe; flere studier har indikert at følsomheten varierer fra 50 til 100%, og i vår studie var den komparative følsomheten med nPCR 66.6%. Noen studier har antydet at den lave teknikken følsomhet skyldes behovet for en stor virale partikler mengder som skal kastes inn i avføring av hunder for å oppnå en positivdiagnose . Bruken av denne teknikken må revurderes, da høyere sannsynlighet for falske negative resultater forventes. For å forhindre dette må ytterligere teknikker med høyere følsomhet brukes .

Flere studier har vist HØY følsomhet FOR PCR-baserte tester; for tiden er det flere varianter av samme prosedyre som gir følsomhetervarierer fra 80 til 100% . I denne studien HADDE PCR 80% følsomhet, og det er bemerkelsesverdig å nevne at pasientene bare ble identifisert positive til infeksjon gjennom nPCR, mens VERKEN PCR eller immunokromatografitester var i stand til å identifisere det.

når det gjelder kappa-verdien, sammenlignet vi resultatene blant de tre analyserte metodene med nPCR. Den dårlige avtalen mellom klinisk diagnose og npcr ble likevel demonstrert; moderat avtale ble observert mellom konvensjonell PCR og nPCR som kan skyldes likheten mellom de to testene.

når det Gjelder kliniske tegn, ble det observert enten oppkast eller diare hos alle viralt infiserte pasienter, mens andre kliniske tegn ikke ble vurdert som relevante for infeksjonen. 26 viste bare oppkast som et klinisk tegn, og det ble ansett negativt for CPV-2 ved veterinær klinisk diagnose, men immunokromatografitest, PCR og npcrtest var positive TIL CPV-2. Videre kunne tilfeller 41 og 42 der det viktigste kliniske tegnet var diare, bare diagnostiseres positivt FOR CPV-2 ved bruk av nPCR.

våre data indikerer at de mest brukte diagnostiske testene i kliniske og diagnostiske veterinærlaboratorier for å oppdage CPV-2 er svært spesifikke, men de mangler følsomhet, som forhindrer presis diagnose AV CPV-2. I vår studie VAR PCR-og immunokromatografitest ikke like følsom som nPCR, som ble bekrefteti tidligere undersøkelser er imidlertid bruken av nPCR som diagnosetest ennå ikke utbredt på veterinærsykehus, mens den fortsatt er mye brukt til forskningsformål.

På den annen side Brukes Real-Time PCR, som også er svært følsom, sjelden på grunn av høye utstyrskostnader og kravet om en svært spesialisert stab for håndtering. Men teknologiske fremskritt tillot disse teknikkene å bli billigere og enklere å bruke, noe som kan føre til direkte anvendelse på veterinærsykehus for å forbedre diagnostisk nøyaktighet FOR CPV-2.