proteinrensingrediger
Polyhistidin-tagger brukes ofte til affinitetsrensing av polyhistidin-merkede rekombinante proteiner uttrykt i Escherichia coli og andre prokaryotiske ekspresjonssystemer. Bakterieceller høstes via sentrifugering og den resulterende cellepellet lyseres enten ved fysiske midler eller ved hjelp av vaskemidler og enzymer som lysozym eller en kombinasjon av disse. På dette stadiet inneholder rålysat det rekombinante proteinet blant mange andre proteiner som stammer fra bakteriell vert. Denne blandingen inkuberes med en affinitetsharpiks som inneholder bundet divalent nikkel-eller koboltioner, som er tilgjengelige kommersielt i forskjellige varianter. Nikkel og kobolt har lignende egenskaper og som de er tilstøtende periode 4 overgangsmetaller (v. jern triade). Disse harpiksene er vanligvis sefarose/agarose funksjonalisert med en chelator, slik som iminodieddiksyre (Ni-IDA) og nitrilotrieddiksyre (Ni-NTA) for nikkel og karboksylmetyl aspartat (Co-CMA) for kobolt, som polyhistidinmerket binder med mikromolar affinitet. Ernst Hochuli et al. koblet 1987 NTA ligand Og Nikkel-ioner til agarose perler. Harpiksen vaskes deretter med fosfatbuffer for å fjerne proteiner som ikke spesifikt interagerer med kobolt eller nikkelion. Med Ni-baserte metoder kan vaskeeffektiviteten forbedres ved tilsetning av 20 mM imidazol (proteiner elueres vanligvis med 150-300 mM imidazol). Generelt har nikkelbaserte harpikser en høyere bindingskapasitet, mens koboltbaserte harpikser gir den høyeste renheten. Renheten og mengden protein kan vurderes AV Sds-PAGE og Western blotting.
Affinitetsrensing ved bruk av en polyhistidin-tag resulterer vanligvis i relativt rent protein når det rekombinante proteinet uttrykkes i prokaryote organismer. Avhengig av nedstrøms applikasjoner, inkludert rensing av proteinkomplekser for å studere proteininteraksjoner, kan rensing fra høyere organismer som gjær eller andre eukaryoter kreve en tandemaffinitetsrensing ved hjelp av to koder for å gi høyere renhet. Alternativt gir enkeltrinns rensing ved hjelp av immobiliserte koboltioner i stedet for nikkelioner generelt en betydelig økning i renhet og krever lavere imidazolkonsentrasjoner for eluering av det his-merkede proteinet.
Polyhistidinmerking er det foretrukne valget for rensing av rekombinante proteiner under denatureringsforhold fordi virkningsmåten kun er avhengig av proteinenes primære struktur. For eksempel, selv når et rekombinant protein tvinges uttrykt I E. coli produserer en inkluderingslegeme og kan ikke oppnås som et løselig protein, det kan renses med denaturering med urea eller guanidinhydroklorid. Ved høy pH binder histidin til nikkel eller kobolt, men ved lav pH (~6 for kobolt og ~4 for nikkel) blir histidin protonert og konkurreres av metallionen. Sammenlign dette med antistoffrensing og gst-rensing, en forutsetning som er riktig (innfødt) folding av proteiner involvert. På den annen side sies Det At his-taggen har en tendens til å aggregere og insolubilisere mer enn andre affinitetskoder.
Polyhistidin-tag kolonner beholder flere kjente proteiner som urenheter. EN av dem ER fkbp-type peptidyl prolyl isomerase, som vises rundt 25kDa (SlyD). Urenheter elimineres vanligvis ved hjelp av en sekundær kromatografisk teknikk, eller ved å uttrykke det rekombinante proteinet i En SlyD-mangelfull e. coli-stamme. Alternativt, sammenligning med nikkelbaserte koboltbaserte harpikser har mindre affinitet Med SlyD fra E. coli, men i flere tilfeller er det moderat nyttig.
Separering av ett fra to polyhistidinmerkerrediger
Proteiner med forskjellig antall polyhistidinmerker eluerer forskjellig fra nikkelaffinitetsharpiks. For proteiner med en enkelt hexahistidin-tag muliggjør 75 mM imidazol eluering Fra Ni-NTA, mens for proteiner med to hexahistidin-tagger kreves 100 mM imidazol for eluering. Denne trinnvise elueringen kan brukes til å isolere spesifikke proteinaggregater fra en blanding, slik som definerte heteromultimere (f.eks. en AB-heterodimer fra en blanding inkludert AA og BB-homodimerer, hvis bare underenhet B har en polyhistidin-tag). En slik tilnærming ble brukt i isolasjon av monovalent streptavidin.
bindingsanalyserediger
Polyhistidinmerking kan brukes til å oppdage protein – protein-interaksjoner på samme måte som en nedtrekksanalyse. Imidlertid er denne teknikken generelt ansett for å være mindre følsom, og også begrenset av noen av de mer pirkete aspektene ved denne teknikken. For eksempel kan reduserende forhold ikke brukes, EDTA og mange typer vaskemidler kan ikke brukes. Nylige fremskritt innen dual polarisation interferometri er mottagelig FOR EDTA og en bredere bruk av reagenser, og bruken av slike stedsspesifikke koder forenkler direkte måling av tilhørende konformasjonsendring.
Hexahistadine CyDye tagger har også blitt utviklet. Disse bruker Nikkelkovalent koordinering TIL EDTA-grupper festet til fluoroforer for å skape fargestoffer som festes til polyhistidin-taggen. Denne teknikken har vist seg å være effektiv for å følge proteinmigrasjon og menneskehandel. Det har også vært nyere funn som viser at denne teknikken kan være effektiv for å måle avstand via Fluorescerende Resonans Energioverføring.
en polyfluorohistidin tag er rapportert for bruk i in vitro oversettelsessystemer. I dette systemet brukes en utvidet genetisk kode der histidin erstattes av 4-fluorohistidin. Den fluorerte analogen inkorporeres i peptider via den avslappede substratspesifikiteten til histidin-tRNA ligase og senker den totale pka av taggen. Dette muliggjør selektiv anrikning av polyfluorohistidin-merkede peptider i nærvær av komplekse blandinger av tradisjonelle polyhistidin-koder ved å endre pH i vaskebufferne.
