Sammenligning Mellom Konvensjonell Avkalking og En Mikrobølge-Assistert Metode I Benvev Påvirket Med Mycetoma

Abstrakt

Mycetoma er en livslang granulomatøs sykdom i subkutant vev og ben. Histopatologi er en begrunnet indikativ metode basert på antagelsen om en endelig diagnose av myketom. Det krever effektiv behandling av vev, inkludert benavkalkning. Avkalking prosessen må sikre fullstendig fjerning av kalsium og også en skikkelig bevaring av vev og mikroorganismer’ farging evne. Mål. For å sammenligne den konvensjonelle metoden som brukes i avkalking med mikrobølgemetoden ved hjelp av forskjellige avkalksløsninger. Ulike egenskaper ble testet, inkludert hastigheten på avkalkning og morfologisk og soppbevarelse i beinvev påvirket av myketom. Materialer Og Metoder. Tre avkalkning løsninger ble anvendt for å fjerne kalsium fra 50 bein vevsprøver påvirket med mycetoma, inkludert 10% nøytral bufret EDTA (pH 7,4), 5% salpetersyre, og 5% saltsyre. Konvensjonelle og mikrobølge metoder ble brukt. Haematoxylin – EOSIN (HE) flekken, Gridley ‘ s flekken, Og Grocott hexamine-sølv flekken ble ansatt for å evaluere bein og sopp morfologi. Resultat. Avkalkingstiden for den konvensjonelle metoden sammenlignet med mikrobølgemetoden med 10% EDTA (pH 7,4) tok 120 timer og 29 timer, mens 5% saltsyre og 5% salpetersyre tok 8 timer og 3 timer, separat. Også, 10% EDTA er det beste avkalkningsmidlet FOR HAN flekker og sopp flekker. 5% saltsyre og 5% salpetersyre kan brukes til soppfarging. Konklusjon. Den nåværende studien undersøkte effekten av forskjellige avkalkningsmidler samt to avkalkingsprosedyrer på bevaring av beinstrukturen og soppfarging, noe som vil bidra til å utvikle egnede protokoller for analysene av beinvevet som er berørt av mycetominfeksjon.

1. Innledning

Mycetoma er en livslang granulomatøs, gradvis skadelig epidemisk sykdom i hud og subkutant vev som kan utvikle seg til dypere strukturer som muskler og bein og føre til omfattende ødeleggelse, hovedsakelig av føttene, som krever brede lokale kirurgiske excisions eller lem amputasjon . Mycetoma er definert av triumviratet av ekspansjon, utmattende bihuler og eksistensen av kolonikorn i de inflammatoriske ekssudatene . Infeksjon er klassifisert som eumycetom (soppinfeksjon) eller actinomycetom (bakteriell infeksjon) . Det er stort sett en tilstand av tropiske og semitropiske regioner, merkbart Sudan . Madurella mycetomatis korn er store, alt fra 0,5 til 3 mm, og vises avrundet, oval, eller trilobed. De består av krysshyphae innblandet i interstitial brunaktig sement, bestående av melaninlignende, svartbrunt pigment . Histopatologi er en rask indikativ metode samt fordelaktig prosess på antagelsen om en endelig diagnose av mycetoma sykdom og inkluderer en rapport som beskriver den morfologiske presentasjonen av årsaksmidlene. Kausjonsmiddelet kan fortsatt isoleres fra det involverte beinvevet . Avkalking er et grunnleggende trinn som vanligvis oppnås for histopatologisk undersøkelse av bein . Mineralene i bein består av kalsium og fosfor, og uoppløselige salter utgjør mer enn seksti prosent av beinvev . Disse mineralene gir beinhardhet og er årsaken til vanskeligheter under vevskjæring ved hjelp av roterende mikrotomer . Slike vev må behandles for å trekke ut kalsiumfosfat ved en prosedyre kjent som avkalkning, ved å gjøre vevet tilstrekkelig delikat til å bli kuttet av mikrotomet. Avkalking oppnås ved syrer som danner oppløselige kalsiumsalter eller chelateringsmidler som binder seg til kalsiumioner. De nåværende konvensjonelle avkalkningsmetoder er preget av vanskelige prosesser og vedvarende svikt i vevets fargereaksjon . I den konvensjonelle metoden for avkalking plasseres benvev i et avkalkingsvæske ved romtemperatur med endringer i løsningen med jevne mellomrom til sluttpunktet er nådd. Mikrobølgeavkalkning er en nyskapende teknikk sammenlignet med den konvensjonelle metoden . I denne prosessen plasseres faste vev i avkalkingsløsningen i en mikrobølgeovn for periodiske varigheter med vanlige skift av avkalkingsvæskene til sluttpunktet er oppnådd. Mikrobølgestråling har blitt utført for å akselerere prosedyren for avkalking omtrent fra dager til timer . Målet med denne studien var å sammenligne den konvensjonelle metoden som brukes i avkalking med den modifiserte mikrobølgemetoden ved bruk av forskjellige avkalkingsløsninger. Ulike egenskaper ble testet, inkludert hastigheten på avkalkning og morfologisk og soppbevarelse i beinvev påvirket av madurella mycetomatis-infeksjon.

2. Materialer Og Metoder

Dette er en eksperimentell beskrivende studie som tar sikte på å sammenligne den konvensjonelle avkalkingsprosedyren med mikrobølgeforsterket avkalking med hensyn til vevsmorfologi påvirket av mycetoma-infeksjon ved bruk av hematoksylin og eosin, Gridley og Grocott hexamine-silver flekker for fullstendig identifisering Av Madurella mycetomatis kausale organismer. Denne studien ble utført Ved Mycetoma Research Center I Soba Universitetssykehus og Fakultet For Medisinsk Laboratorievitenskap, University Of Al Neelain. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter. Femti amputerte lemmer berørt med mycetom ble samlet. Benbiopsier ble kuttet ved hjelp av en egnet sag i 5 mm tykke stykker og deretter festet i 10% formell saltvann i 48 timer. De ble vasket under rennende vann fra springen i 30 minutter for å fjerne fikseringsmiddel.

2.1. Konvensjonell Avkalkingsprosedyre

Tre stykker med 5 mm tykke deler av benbiopsier ble nedsenket i tre 250 ml Pyrex Squat Beger som hver inneholdt 100 ml 5% vandig saltsyre (HCl), 5% vandig salpetersyre (HNO3) og 10% etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) plassert ved romtemperatur (gjennomsnittlig 28°C), Se Tabell 1. Sluttpunktet for avkalking ble kontrollert ved hjelp av kalsiumoksalatmetoden for de to syredekalkifiseringene (5% HNO3 og 5% HCl) etter et to-timers intervall som følger: 5 ml av den brukte avkalkingsvæsken ble tatt og plassert i et reagensrør, deretter ble lakmuspapir tilsatt, og ammoniakkhydroksyd ble tilsatt dråpevis til lakmuspapiret endret, noe som indikerte alkalisk pH-avkalkingsvæske var klart. 5 ml mettet ammoniumoksalatløsning ble tilsatt når avkalkingsløsningen ble uklar, noe som indikerer tilstedeværelsen av kalsium i beinvev, slik at avkalkingsløsningen ble erstattet med ny løsning, og prosessen ble gjentatt hvert 30.minutt til fullføringen av avkalkingsprosessen. FOR EDTA ble avkalkingsfysisk testing brukt der avkalkingsprosessen ble ansett å ha avsluttet når beinet lett ble penetrert gjennom en nål. Gjennomsnittlig total avkalket tid var henholdsvis 7 timer og 30 minutter, 8 timer og 120 timer for 5% salpetersyre, 5% HCl og 10% EDTA.

2.2. Mikrobølgeovn Prosedyre

et hus mikrobølgeovn (Midea Mikrobølgeovn 20L, 700w, Digital, EM720CFF) med en fast roterende plate ble brukt. Et glassbjelke inneholdende 100 ml destillert vann ble forvarmet i 5 sekunder for å varme opp magnetronen. Dette ble erstattet av 100 ml fersk destillert vann og bestrålt for å opprettholde temperaturen på rundt 41-43°C. Dette tok 15 sekunder. Glassbegeret ble tildelt på ulike punkter i ovnen mens bestråling det å løse den beste plasseringen av prøven under mikrobølgeovn avkalking siden mikrobølgeovnen brukes hadde en konstant timing, men ikke en konstant temperatur. Tre deler med 5 mm tykke benbiopsier ble nedsenket i 250 ml Pyrex Squat Beger inneholdende 100 ml 5% vandig saltsyre (HCl), 5% vandig salpetersyre (HNO3) og 10% EDTA. Deretter ble de overført til mikrobølgeovnen, og prøvene ble bestrålt i ti sykluser på ti sekunder hver (ved 15 minutters intervaller) i en total tid på 2-4 timer for syreavkalkere(5% HNO3 og 5% HCl). Temperaturen på avkalkingsløsningen ble opprettholdt på rundt 41-43°C. avkalkingsløsningen og sluttpunktet for avkalkingen ble kontrollert, og avkalkingsløsningen ble gjentatt endret til fullføring av avkalkingen. Sluttpunktet for avkalking ble kontrollert ved bruk av kalsiumoksalat og fysiske tester som nevnt ovenfor. Gjennomsnittlig total avkalket tid var 3 timer og 45 minutter, 5 timer og 30 minutter, og 29 timer og 4 minutter for henholdsvis 5% salpetersyre, 5% HCl og 10% EDTA. Etter fullstendig avkalking ble vevene vasket ved bruk av destillert vann og overført til 0,3% ammoniakkoppløsning i 5 minutter for å nøytralisere syren som ble brukt.

2.3. Vevsbehandling Og Farging

prøvene ble utsatt for automatisk vevsbehandling ved hjelp av følgende protokoller: beinbiopsiene ble plassert i 10% formell saltvann i en time. Deretter endres 50% alkohol en time, 70% alkohol en time, 90% alkohol en time, etterfulgt av 100% alkohol tre hver to timer hver, xylen to endringer, hver i en og en halv time, til slutt parafinvoks to endringer hver i to timer. Vevene var innleiret i parafinblokker og ble delt inn i en tykkelse på 5-6 µ ved bruk av et roterende mikrotom. Seksjoner ble farget Med Mayer ‘ s haematoxylin, som beskrevet Av Mayer i 1903, og motparten i hver var 1% eosin (HE) . Gridleys flekk ble brukt til soppdemonstrasjon som beskrevet Av Gridley i 1953); etter deparaffinisering og rehydrering ble vevseksjoner plassert i 2% kromsyre i 30 minutter. De ble deretter vasket godt med vann fra springen, skyllet med destillert vann, og deretter plassert I Schiffs reagens i 20 minutter. De ble deretter vasket i rennende vann fra springen i 10 minutter og skylles med 70% etanol og deretter med 95% etanol. De ble counterstained Med Metanil Gul i ett minutt og skylles godt med destillert vann. Deretter ble de dehydrert i xylen og montert i distyren, en mykner og xylen (DPX). Deretter ble seksjonene undersøkt under et mikroskop . Grocott hexamine-silver-metoden for sopp som beskrevet Av Grocott i 1955 ble også brukt i hvilke seksjoner ble oksidert med 4% vandig kromsyre i en time, vasket i vann i noen sekunder, behandlet med 1% natriummetabisulfitt i ett minutt, vasket i rennende vann fra springen i 3 minutter, skylles grundig i destillert vann, plassert i forvarmet sølvoppløsning i et vannbad ved 60°C i 20 minutter, skylles godt i destillert vann, vaskes med rennende vann fra springen i 5 minutter, counterstained i arbeidslysegrønn i 15 sekunder, dehydrert. og ryddet I Xylen og montert i DPX, og til slutt undersøkt under et mikroskop.

2.4. Evaluering Av Resultater

Seksjoner ble evaluert av en ekspert histopatolog. Kvaliteten på avkalkingsprosedyren og fargeresultatet ble også vurdert og evaluert av tommelfingerregelen, og kvaliteten på avkalkingen ble evaluert etter følgende kriterier: tidspunktet for avkalkning, morfologisk bevaring av vevsmorfologi og Madurella mycetomatis sopp AV HE; Gridley og Grocott methenamine-silver-farging ble gradert fra 1 til 4 (1: dårlig, 2: rettferdig, 3: god og 4: utmerket) .

2.5. Statistisk Analyse

dataanalyse ble utført ved HJELP AV SPSS-programmet. Enveis ANOVA ble brukt til å bevise effekten av de tre avkalkende løsningene på kvantitativ analyse av seksjonskvalitet og soppbeskyttelse. Kruskal-Wallis-testen ble utført for å avgjøre om det var en signifikant forskjell mellom de testede løsningene for hver av parametrene evaluert sammen med de to forsøkene. Forskjeller med ble tolket som statistisk signifikante.

3. Resultater

Femti tilfeller Av Madurella mycetomatis med svart korn ble inkludert i studien. Føttene var den mest berørte anatomiske regionen i 48 tilfeller (96%) og to tilfeller (4,0%) i hånden. Med hensyn til avkalking i forskjellige eksperimenter, blant de tre testede løsningene, tok avkalking med 10% EDTA (pH 7,4) lengst tid for den konvensjonelle metoden (opptil 120 timer sammenlignet med 29 timer med mikrobølgeovnen), og bruken av en syre-avkalking løsning tok kortest tid fra 8 timer til 3 timer for forskjellige avkalking metoder. Kvaliteten på vevsmorfologien til forskjellige typer avkalking av oppløsning ved bruk av avkalking av mikrobølgemetoden sammenlignet med den konvensjonelle metoden Med Mayers hematoksylin-og eosinfarging med hensyn til nukleær og cytoplasmatisk utseende oppnådde variable resultater. Også 10% EDTA-avkalket bein syntes å ha et signifikant bedre resultat (P-verdi ved bruk av chi-kvadrat test: 0,023) sammenlignet med 5% HNO3 og 5% HCl. Utmerket fargingsrapport var 43 (86%) versus 32 (64%), 42 (84%) mot henholdsvis 18 (36%) og 33 (66%) mot 1 (2%). Grocott methenamine-silver stain-metoden ble brukt til demonstrasjon Av madurella mycetomatis forårsakende middel angående morfologi og lysstyrke av sopp, og vevsseksjoner avkalket med 10% EDTA, 5% HNO3 og 5% HCl ved bruk av konvensjonelle og mikrobølge metoder viste signifikant bedre soppmorfologi (P-verdi ved bruk av chi-kvadrat test: 0,001) som følger: 33 (66%) versus 32 (64%), 33 (66%) mot henholdsvis 39 (78%) og 22 (44%) mot 31 (62%). Den andre sopp flekken brukes For Madurella mycetomatis Var Gridley flekken om sopp morfologi og flekker kvaliteten på bein avkalket med 10% EDTA, 5% HNO3, og 5% HCl ved hjelp av konvensjonelle og mikrobølgeovn metoder som viste betydelig bedre funn (p verdi ved hjelp av chi-square test: 0,003) som følger: 43 (86%) versus 41 (82%), 32 (64%) mot henholdsvis 34 (68%) og 23 (46%) mot 35 (70%). Disse resultatene er oppsummert I Tabell 2. Figur 1 viser fargeresultatene ved bruk av forskjellige avkalkningsmidler og forhold.

Figur 1

Demonstrasjon av fargeresultater ved bruk av forskjellige avkalkningsmidler og forhold.

4. Diskusjon

den histopatologiske identifikasjonen Av kausjonsmiddelet Til Madurella mycetomatis er godt etablert som det er gullstandardprosedyren; imidlertid krever hardt vev og bein spesiell avkalkning for å bevare vevstrukturen og kausjonsmiddelmorfologien. De forårsakende midler kan identifiseres ved hjelp av haematoxylin og EOSIN (HE) og sopp spesielle flekker, slik at benet krever en standard avkalkning protokoll som bevarer vev, patogen morfologi, og beis evne. Bone decalcification er en kjedelig teknikk. Det krever uker, og bevaring av vevskonfigurasjonen avhenger av kvaliteten og hastigheten til avkalkingsprosedyren. En ny prosess ved hjelp av en mikrobølgeovn ble realisert for å øke avkalkingsprosessen . Valget av avkalkningsmidlet og måten er i utgangspunktet bestemt av metodens alvor, og mulige bruksområder av mikrobølge energi i histologiske teknikker ble først dokumentert Av Mayers i 1970. Dette systemet av nonionizing emisjon metoden tenkt å fremskynde avkalking prosessen . Den molekylære kinetikken forårsaker da produksjon av energiendring, som varer til strålingen stopper . I denne studien var avkalkingstider rapportert for mikrobølgeforsterket avkalking og den konvensjonelle avkalkingsprosedyren 29 og 120 timer med 10% EDTA (pH 7,4), tre timer og syv timer med 5% salpetersyre og fem og åtte timer med henholdsvis 5% HCl. Det er klart at mikrobølge avkalkningsmetoden for beinvev påvirket av mycetominfeksjon var betydelig raskere enn den konvensjonelle metoden. 5% salpetersyre hadde også raskere avkalkingsevne etterfulgt av 5% saltsyre og DERETTER EDTA (pH 7,4) for begge metoder. Pitol et al. brukt en mikrobølgeovn komfyr for fjerning av kalsium av rottebenet med 8,5% EDTA-løsning og viste en reduksjon av prøveperioden fra 45 dager i den konvensjonelle prosessen til 48 h i mikrobølge-assistert prosess. I dette arbeidet tok 10% EDTA-løsningen 120 timer i konvensjonell metode og 29 timer ved bruk av mikrobølger for å oppnå fullstendig avkalking av beinvevet som var berørt av mycetominfeksjon. Konsentrasjonen AV EDTA i vårt eksperiment var mer Enn Pitol et al.studie. I tillegg til forskjeller i størrelse, tykkelse og typer av beinet, kan disse være mulige forklaringer for økninger i tid for avkalkning I Pitol et al.s studie som ble redusert i vår setting. Videre tok avkalking av beinet påvirket av mycetoma-infeksjon med den konvensjonelle metoden ved bruk av 5% salpetersyre syv timer, mens mikrobølgeovnmetoden tok tre timer. Sammenlignbare resultater ble oppnådd Av Balaton og Loget . Videre, i denne forskningen, avkalking ganger ble redusert fra andre studier. Avkalking ganger rapportert for konvensjonelle og mikrobølgeovn metoder varierte fra en dag og fire timer til 5 dager og anses lav i sammenligning med andre studier i gnager bein, som har rapportert ganger mellom 2 og 7 dager med syre-avkalking løsninger og 10% EDTA (pH 7,4), henholdsvis . Shibata og hans gruppe rapporterte nesten lignende avkalkingstider som varierte fra 1 dag til 7 dager med 10% HCl, 10% salpetersyre og 10% EDTA. Imidlertid brukte de syre avkalkingsmidler med høyere konsentrasjoner . Uma et al. evaluerte effekten av fire forskjellige avkalkingsvæsker ved bruk av mikrobølgekalkifisering i rottebeinet og rapporterte 1 til 1,5 dager for 5% salpetersyre og 7% HCl/2% EDTA. IMIDLERTID tok 10% EDTA 14 til 26 dager i henhold til typen av beinet . I disse studiene varierte beintypen, naturen og størrelsen og skilte seg fra de som ble analysert her. Avkalkingsprosedyren var en viktig årsak til overlegenhet av vevsdelen og presisjonen av farging. Philipp et al. (2019) beskrev at avkalkingsmetoden forårsaker signifikante morfologiske endringer som endrer proteinstrukturen og påvirker vevets fargeevne . I vår studie ble benet behandlet med 5% salpetersyre med den rutinemessige manuelle metoden, og det var hevelse i bløtvev og tap av nukleær-og soppfarging sammenlignet med mikrobølge-assistert avkalking. Syre-avkalkningsmidler forstyrrer vanligvis bein og bløtvevskonstans. Disse spesielle effektene i 5% salpetersyre er på grunn av perioden tatt og surheten av løsningen. Dermed vil raskere avkalking føre til større skade Og større effekter I H& E og sopp spesiell flekk. Flere sopp kan påvises med en histologisk seksjon ved hjelp av histokjemiske flekker som Grocott ‘ s methenamine-silver (GMS) stain og/eller Gridley (GS) stain . Noen sopp kan demonstreres nøyaktig i vev basert på morfologiske strukturer; imidlertid hadde anerkjennelseseffekten en tendens til å avta etter langvarig fiksering og avkalkning ved bruk av konvensjonelle metoder . I denne studien ga mikrobølge-assistert avkalking overlegen farging sammenlignet med den konvensjonelle metoden For morfologi ved Bruk Av H& E og fungal special beis, hvor 10% EDTA var løsningen som best bevarte vevstrukturer og soppfargingsevne til tross for lang tid for avkalking.

5. Konklusjon Og Anbefalinger

Avkalking forbedret ved bruk av mikrobølgeovn er en ny teknikk for avkalking. Denne teknikken ble undersøkt i benvev påvirket Av madurella mycetomatis-infeksjon ved bruk av 10% EDTA, 5% salpetersyre og 5% saltsyre som avkalkende væsker. Dette ble sammenlignet med konvensjonell avkalking ved romtemperatur for å bestemme hastigheten på avkalking og vevsmorfologi ved Bruk Av Mayers hematoksylin-og eosin-flekk for beinstrukturen og Grocott-og Gridley-flekker for soppmorfologi. Bedre resultater ble oppnådd sammenlignet med den konvensjonelle metoden både i cellemorfologi og sopp spore og hyphae med redusert sopp lysstyrke ved romtemperatur. Dette funnet kan bidra til å utvikle egnede protokoller for analyser av benvev påvirket av mycetoma infeksjon.

6. Begrensninger Av Denne Studien

en større utvalgsstørrelse ville ha gitt mer avgjørende resultater. Også tider tatt for avkalking vil trolig være forskjellige hvis forskjellige beinvekter og beinprøver annet enn hender brukes, siden avkalkingstiden er avhengig av størrelsen og strukturell tetthet av det harde vevet. Til slutt, siden vi har brukt en innenlandsk mikrobølgeovn, kan våre temperaturopptak bare ha vært omtrentlige.

Datatilgjengelighet

datasettene generert under den nåværende studien er tilgjengelige fra den tilsvarende forfatteren på rimelig forespørsel.

Etisk Godkjenning

denne studien ble godkjent Av Institutional Review Board Av Fakultetet For Medisinsk Laboratorievitenskap, Universitetet I Al Neelain.

Interessekonflikter

forfatteren erklærer at det ikke er noen interessekonflikter.

Takk

forfatteren ønsker å uttrykke sin oppriktige takknemlighet til de ansatte I Mycetoma Research Center, Universitetet I Khartoum, Khartoum, Sudan, og spesiell takknemlighet til professorene Ahmed Hassan Fahal Og Ahmed Mohammed El Hassan, emeritus professor i patologi, for deres hjelp.

Supplerende Materialer

materialene og reagensene som brukes til å støtte funnene i denne studien, er inkludert i tilleggsinformasjonen. (Supplerende Materialer)