TUNEL-analysen brukes mest Til å oppdage celler som gjennomgår apoptose, som er en form for programmert celledød. Apoptose er en viktig biologisk prosess under utvikling, og for å opprettholde vevshomeostase. TUNEL farging muliggjør visualisering og kvantifisering av apoptotiske celler. Dette hjelper forskere med å teste effekten av nye behandlinger for lidelser der apoptose enten er hemmet, som i kreft, eller forbedret, som i nevrodegenerasjon.
denne videoen vil forklare hvordan TUNEL-analysen kan brukes til å merke celler som gjennomgår apoptose, en trinnvis protokoll for å utføre denne metoden i vevsseksjoner, og hvordan forskere bruker denne teknikken til å forstå mekanismer for celledød.
før vi drar inn i PROTOKOLLEN TIL TUNEL-analysen, la oss diskutere prinsippene bak denne teknikken.
EN av de mange kjennetegn ved apoptose er DNA-fragmentering. HVORDAN OPPSTÅR DNA-fragmentering? Apoptose utføres av enzymer kalt caspaser tilstede i cytosol. Deres primære rolle er å spalte proteiner for å demontere cellen. I tillegg aktiverer caspases et enzym kalt caspase-aktivert DNase, ELLER CAD, ved å løsne det fra inhibitoren-ICAD. Aktivert CAD er en endonuklease som reiser til kjernen og spalter kromosomalt DNA.
Spaltning av DNA forårsaker til slutt akkumulering AV DNA-fragmenter med nikkede ender, og TUNEL-analysen fluorescerende merker disse nikkede endene av fragmentert DNA, slik at forskere kan oppdage apoptose. Men hvordan skjer dette? For det må du forstå TUNEL-reaksjonen. TUNEL står for terminal deoksynukleotidyltransferase-mediert dUTP nick-end merking. DE to VIKTIGSTE TUNELREAGENSENE er terminal deoksynukleotidyltransferase, Eller TdT, og deoksyuridintrifosfat eller dUTP, som kan være fluorescerende merket for enkel deteksjon.
for å forstå TUNEL-reaksjonen, la oss gå tilbake til apoptotiske celler med DNA-fragmenter. Disse hakkede fragmentene har frie 3 ‘ hydroksylgrupper. Når DU legger TUNEL reagenser til en prøve som inneholder apoptotiske celler, fluorescently merket dUTPs feste til disse 3 ‘ hydroksyl grupper ved hjelp av katalysator enzymet TdT. Cellene farget ved hjelp av denne prosedyren kalles TUNEL positive celler, som deretter kan visualiseres ved hjelp av fluorescensmikroskopi.
Nå som du forstår de grunnleggende prinsippene og konseptene bak TUNEL-analysen, la oss skissere en generell protokoll for å utføre denne teknikken i vevsseksjoner. De viktigste trinnene I TUNEL-analysen inkluderer å fikse vevet av interesse, permeabilisering av vevet, legge TIL TUNELREAGENSER, stoppe TUNELREAKSJONEN og til slutt analysen.
først må vevet av interesse festes for å bevare biologiske strukturer. Fiksering fungerer ved tverrbindende proteiner i celler. FOR TUNEL-analysen kan vev fikses ved å tilsette dem til en oppløsning som inneholder 4% paraformaldehyd i 4-24 timer ved 4°C. etter fiksering, kryoseksjon vevet i tynne skiver på 10 µ eller mindre.
det neste trinnet er permeabilisering, noe som gjør det mulig for reagenser som TdT-enzymet å trenge inn i cellekjernen. Permeabilisering av vevsseksjoner kan utføres ved å tilsette vevet til proteinase K-oppløsning i 5-15 minutter ved 37°C. Skyll vevsseksjoner med fosfatbufret saltvann på en orbital shaker i 15-30 minutter ved romtemperatur.
Etter permeabilisering blir tdt-enzymet og fluorescerende merkede dUTPs tilsatt til vevsseksjonene, sammen med en merkingsbuffer som inneholder kobolt som fungerer som en kofaktor for TUNELREAKSJONEN. SAMMEN inkuberes TUNEL-reaksjonsblandingen og vevsdelen i 1-3 timer ved 37°C, og beskyttes mot lys for å forhindre at fluorescensen falmer.
etter inkubering legges stoppbuffer til vevsdelen for å stoppe TUNELREAKSJONEN, og etter en kort inkubasjon vaskes seksjonene med fosfatbufret saltvann. Endelig, vev seksjoner farget ved hjelp av fluorescently merket dUTP er visualisert ved hjelp av fluorescens mikroskopi, og vurdert for lokalisering AV TUNEL positive celler i et gitt vev. Man kan kvantifisere celledød ved å telle prosentandelen AV TUNEL positive celler i en gitt vevsseksjon.
Nå som du har sett HVORDAN DU utfører TUNEL-analysen for å oppdage apoptotiske celler, la oss diskutere hvordan denne analysen kan brukes til å ta opp spørsmål fra cellebiologer.
Celledød forekommer som en normal del av utviklingen for skulptur av vev og strukturer, og for eliminering av unødvendige celler. Derfor studerer forskere interessert i dette fenomenet effekten av prenatal eksponering for forskjellige stoffer på apoptose under utvikling. Her var forskere interessert i å undersøke effekten av prenatal alkoholeksponering på hjernens utvikling. Resultatene AV TUNELFARGING utført på føtale hjerner viste økt apoptose i vev som var prenatalt utsatt for alkohol, sammenlignet med kontrolldyr.
Forskere bruker OGSÅ TUNEL-analysen til å undersøke apoptose som respons på bakteriell infeksjon. I dette eksperimentet utviklet forskere en modell av lungebetennelse ved å injisere mus Med Pseudomonas aeruginosa, noe som induserer lungebetennelse. Deretter ble lungevev fjernet og TUNELFARGING ble utført for å undersøke apoptose som respons på bakteriell infeksjon. Resultatene viser at apoptotisk celledød økte hos mus utsatt for bakteriene, sammenlignet med kontrolldyr.
TIL Slutt KAN TUNELFARGING brukes på humane tumorprøver, for å bestemme tumorresponsivitet mot rusmidler. I dette eksemplet ble tumorprøver høstet fra humane pasienter og dyrket ex vivo. Deretter ble de behandlet med prekliniske legemidler og vurdert for et svar ved HJELP AV TUNEL-analysen. Data oppnådd viser at behandling med et stoff som hemmer varmesjokkprotein 90 øker apoptose i tumorvev betydelig.
Du har nettopp sett JoVE ‘ s video om bruk AV TUNEL-analysen for å oppdage celler som gjennomgår apoptose. Denne videoen gjennomgått prinsippene bak TUNEL flekker, og en trinnvis protokoll for å utføre TUNEL analysen på vev seksjoner. Vi har også gjennomgått hvordan denne metoden kan brukes til å forstå programmert celledød under utvikling og sykdom. Som alltid, takk for at du så på!
