EuroMAbNet: Europejska Sieć przeciwciał monoklonalnych

protokoły

produkcja Hybrydomy

hybrydoma jest linią komórkową powstającą z jednej komórki hybrydowej, która jest zdolna do wydzielania przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla jednego epitopu twojego antygenu na stałe w hodowli. Komórka hybrydowa jest wytwarzana przez fuzję specyficznych przeciwciał wytwarzających limfocyty B uodpornionego zwierzęcia (zwykle myszy, szczura lub królika) i które mają skończoną żywotność, z komórką z „nieśmiertelnej” hodowli linii komórek szpiczaka (np. myszy NS-1 lub NS-0).

wytwarzanie komórki hybrydowej myszy

podczas procesu syntezy komórek B wyizolowano ze śledziony myszy, zmieszano z linią komórek szpiczaka myszy i indukowano syntezę glikolem polietylenowym (Peg, patrz dodatek i). (Odpowiednia linia szpiczaka jest stosowana, gdy wykorzystuje się komórki B innych gatunków zwierząt). Powstające hybrydomy hoduje się następnie w pożywce do hodowli tkankowej zawierającej Hipoksatynę, Aminopterynę, Tymidynę (HAT), etap, który zabija wszelkie nieużywane komórki szpiczaka, które mogą wyrosnąć z innych słabszych komórek hybrydomy. Nieusunięte limfocyty B mają ograniczoną zdolność podziału i obumierają naturalnie w kulturze. Dziesięć dni po procesie fuzji, supernatant kultury jest zbierany i testowany na obecność pożądanego przeciwciała.

Schematyczne przedstawienie fuzji komórek

• sterylne środowisko, w którym można przygotować i obsługiwać komórki (przepływ laminarny lub szafka klasy II)
• inkubator ustawiony na 37ºC, z 5% CO2 i wilgotnością 95%
• odwrócony mikroskop
• łaźnia wodna o temperaturze 37ºC, którą można umieścić w szafce
• wirówka z obrotowym wirnikiem
• sterylne przyrządy do sekcji-najlepiej dwa zestawy-każdy składający się z dwóch par nożyczek i kleszczy (jedna zakrzywiona i jedna tępo zakończona).
• kolby do hodowli korniszonów 75 ml-Nr ref. 15430641
• 353047
• pipety sterylne
• wypełniacz pipet
• pipety sterylne pasteur
• a timer

Medium i inne odczynniki (więcej szczegółów w Dodatku A)

• rpmi 1640 wodorowęglan buforowany, z L-glutaminą (Lonza Ref. BE12-702F)
• Rpmi 1640 Hepes buforowane, bez L-glutaminy
• Dobra jakość (testowana wsadowo) wołowa surowica płodowa (Genycell Ref. GCS0101-500)
• penicylina / streptomycyna (Gibco Ref. 15070-063)
• Ultroser G (Pall Ref. 15950-017)
• HAT (Hypoxathine, Aminopterin, Thymidine) (Gibco Ref. 21060-017)
• PEG 1500 (Roche Ref. 10783641001)

przed rozpoczęciem (patrz dodatek A po więcej szczegółów)

• zrób 500 ml środka a
• zrób 500 ml środka a+
• zrób 100 ml środka B
• zrób 100 ml środka C
• zrób 500 ml środka D

rozmrażanie i wzrost komórek szpiczaka

rozmrozić linię komórek szpiczaka i rosnąć w pożywce A. Użyj następującej metody rozmrażania i hodowli linii komórek szpiczaka.

• wyjąć zamrożoną fiolkę z komórkami szpiczaka z magazynu LN2.
• umieść komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37ºC.
• trzymaj pokrywę zamrażającej fiolki nad powierzchnią wody, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia.
• gdy komórki są prawie rozmrożone (pozostaje tylko mały kawałek lodu), przenieś się do okapu hodowli tkankowej.
• przetrzeć zewnętrzną część fiolki 70% etanolem i zdjąć górną część fiolki.
• ostrożnie wyjąć zawiesinę komórek za pomocą sterylnej pipety Pasteura.
• przenieść zawartość do probówki wirówki zawierającej 10 ml pożywki a (Patrz dodatek a)
• delikatnie obracać zawiesinę komórkową w 300 g przez 5 minut.
• Usuń supernatant i wymieszaj komórki w 10 ml świeżego podłoża A i umieść w małej (25 cm2) kolbie.
• weź 1 ml zawiesiny z oryginalnej kolby i dodaj do drugiej z 9 ml medium A. Zapewnia to, że jeśli stężenie w pierwszej kolbie jest zbyt wysokie, dostępne jest drugie (niższe) stężenie komórek.
• włóż kolby do inkubatora CO2. Pamiętaj, aby pozostawić pokrywy kolby lekko otwarte, aby umożliwić wymianę gazową.

proces fuzji

trzy dni przed – przygotuj komórki szpiczaka do fuzji

komórki szpiczaka muszą być w fazie wykładniczego wzrostu podczas ich używania, co wymaga doświadczenia. Jednakże w przypadku utworzenia dwóch kolb o powierzchni 75 cm2 z komórek szpiczaka, jednej w rozcieńczeniu 1:40 i jednej w rozcieńczeniu 1:60 (patrz poniżej), na 3 dni przed fuzją jedna z kolb powinna być idealna w dniu fuzji. (Początkowo zakładanie dodatkowych kolb przy rozcieńczeniach powyżej i poniżej podanych tutaj powinno dostarczyć doświadczenia niezbędnego do oceny tempa wzrostu komórek szpiczaka do kolejnych fuzji).

dzień wcześniej-przygotuj pożywkę

następujące elementy należy przygotować i podgrzać do 37ºC (można je umieścić w inkubatorze na noc).

• dwa x 200ml medium a+ w dwóch kolbach o powierzchni 75 cm2
• 100ml medium B
• 100ml medium C
• 1x4ml PEG 1500 przeniesiony na folię owiniętą (PEG jest światłoczuły) sterylny uniwersalny
• a mini 100 ml wody destylowanej i poprzecinana taśmą na tyle szeroką, że istnieje otwór do trzymania 50 ml rurki Falcon w pozycji pionowej

dzień fuzji

• zabij mysz (zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi), wyodrębnij śledzionę i włóż ją do sterylnego pojemnika zawierającego 5 ml wody destylowanej. medium C.
• wszystkie kolejne kroki muszą być wykonane w laminarnym okapie przepływowym.

• umieścić śledzionę i medium w szalce Petriego.
• przesunąć śledzionę sterylnymi kleszczami, aby ją umyć. Usunąć wszelkie zrosty i przenieść śledzionę do drugiej płytki Petriego
• przeciąć śledzionę na dwie części. Przytrzymaj jedną połowę tępymi kleszczami i używając innej pary zakrzywionych kleszczy, delikatnie drażnij komórki z kapsułki śledziony, uważając, aby usunąć jak najwięcej komórek. Powtórzyć za pomocą drugiej połowy śledziony
• usunąć resztki kapsułki śledziony i za pomocą sterylnej pipety Pasteura dobrze wymieszać komórki, ale bardzo delikatnie.
• przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i użyć kolejnych 5 ml medium C, aby przepłukać szalkę Petriego i dodać do komórek śledziony w probówce.
• Policz komórki szpiczaka i śledziony.
• potrzebujesz proporcji 1 komórki szpiczaka do co 10 komórek śledziony
• Dodaj komórki szpiczaka do stożkowej tubki o pojemności 50 ml.
• wirować zarówno komórki śledziony (probówka 15 ml), jak i komórki szpiczaka w (probówka 50 ml) przez 300 g przez 10 minut.
• bardzo ostrożnie wylej supernatant z obu rurek i delikatnie wymieszaj granulki w 10 ml medium B. Brak FBS do momentu zakończenia procesu fuzji jest niezwykle ważny, ponieważ komórki nie łączą się, jeśli jest obecny FBS)

• Połącz wymieszane komórki śledziony i granulki szpiczaka w jedną probówkę wirówki o pojemności 50 ml.
• odwirować przez 5 minut w 300g.
• bardzo ostrożnie wylej jak najwięcej supernatantu.
• wymieszać osad, delikatnie dotykając rurki na ławce. Nie należy przesuwać granulki ani pipetować, ponieważ spowoduje to rozprowadzenie komórek wokół probówki, zmniejszając liczbę komórek dostępnych do stopienia.
• umieść rurkę w domowej łaźni wodnej.
• dodać 1, 2 ml PEG kropla po kropli w ciągu jednej minuty, delikatnie mieszając co kilka kropli.
• dodaj 1 ml medium B, kropla po kropli w ciągu jednej minuty, delikatnie mieszając co kilka kropli.
• Dodaj kolejne 2 ml środka B, kropla po kropli przez dwie minuty, delikatnie mieszając co kilka kropli.
• Dodaj kolejne 4 ml środka B, kropla po kropli przez cztery minuty, delikatnie mieszając co kilka kropli.
• pod koniec czasu dodaj 8 ml pożywki C.
• Odwiruj rurkę komórek przez 5 minut 300 g.
• bardzo ostrożnie oddziel supernatant i wymieszaj osad komórkowy przez 1 minutę z 10 ml pożywki a+. Aby to zrobić, dodaj kilka ml pożywki, aby zacząć rozkładać pellet. Bardzo delikatnie wyssać te grudki komórek i poruszać się w górę iw dół w pipecie. Wydalić te komórki i powtórzyć proces. Bądź bardzo delikatny, nie zmuszaj granulki, po zakończeniu możesz mieć małe kępki komórek. Komórki są bardzo kruche na tym etapie.
• włóż 10 ml wymieszanej mieszanki fuzyjnej do 190 ml ciepłego medium a+
• ostateczna objętość to 200 ml
• włóż 1 ml tej zawiesiny do każdej studzienki z płytkami 8 x 24 studzienki (2 ml). (Łącznie 192 studnie)
• pozostaw płytki w inkubatorze na noc (około 24 godzin).

dzień po fuzji

• Dodaj 8 ml kapelusza do 200 ml medium a+.
• włóż 1 ml tego selektywnego medium do każdej studzienki z 8 płytek.
• pozostaw płytki w inkubatorze. Kolonie pojawią się od 7 do 10 dni

dodatek I

pożywka do hodowli a:
pożywka RPMI 1640 z L-glutaminą (buforowaną wodorowęglanem) (Lonza Ref. BE12-702F)
+ 10% FBS (Genycell Ref. GCS0101-500)
+ penicylina (100u/ml)/streptomycyna (100 mg / l) (Gibco Ref. 15070-063)

Kultura Medium A+:
RPMI 1640 medium with L-Glutamine (bicarbonate buffered) (Lonza Ref. BE12-702F)
+10% FBS (Genycell Ref. GCS0101-500)
+ Penicillin (100U/ml)/Streptomycin (100mg/l) (Gibco Ref. 15070-063)
+ Ultroser G (1%) (Pall Ref. 15950-017)

Culture Medium B (no FBS):
RPMI 1640 Medium with L-Glutamine (Lonza Ref. BE12-702F)
+ Penicillin (100U/ml)/Streptomycin (100mg/l) (Gibco Ref. 15070-063)

Culture Medium C:
RPMI 1640 Medium with L-Glutamine (Lonza Ref. BE12-702F)
+ 10% FBS (Genycell Ref. GCS0101-500)
+ Penicillin (100U/ml)/Streptomycin (100mg/l) (Gibco Ref. 15070-063)

Culture Medium D:
RPMI 1640 medium with L-Glutamine (bicarbonate buffered) (Lonza Ref. BE12-702F)
+ 10% FBS (Genycell Ref. GCS0101-500)
+ Penicillin (100U/ml)/Streptomycin (100mg/l) (Gibco Ref. 15070-063)
+ Ultroser G (1%) (Pall Ref. 15950-017)
+ HAT (Hypoxathine, Aminopterin, Thymidine) supplement which is usually 50X (dilute 10ml in 500mls of medium) (Gibco Ref. 21060-017)