wielobarwne barwienie barwnikami fluorescencyjnymi jest aktywnie wykorzystywane do obserwacji rozkładu materiałów biologicznych (takich jak białka, lipidy, kwasy nukleinowe i jony) w dziedzinie badań tkankowych i komórkowych. Technologia detekcji dla obserwacji fluorescencji rozwinęła się do poziomu, przy którym pojedyncza fluorescencyjna cząsteczka barwnika może być wykryta w najlepszych okolicznościach. W tej sekcji omówiono kilka ważnych aspektów fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), nowej technologii mikroskopii fluorescencyjnej. Oprócz barwienia wielobarwnego, obrazowanie żywotności fluorescencji można również wykorzystać do wizualizacji czynników, które wpływają na właściwości żywotności fluorescencji cząsteczki barwnika, czyli stanu środowiska wokół cząsteczki.
Spektroskopia długości fali
konwencjonalna mikroskopia fluorescencyjna wykorzystuje właściwości kolorów barwników fluorescencyjnych, to znaczy identyfikacja opiera się na różnicach w charakterystyce spektralnej fluorescencji między barwnikami. Dzięki tej technice pięć lub sześć barwników w zakresie długości fali od ultrafioletowego do bliskiej podczerwieni można stosować jednocześnie pod mikroskopem bez pomylenia kolorów.
Spektroskopia Dożywotnia
każdy barwnik fluorescencyjny ma swój własny czas życia w stanie wzbudzonym. Wykrywając różnice w żywotności, możliwe jest rozróżnienie nawet barwników o tym samym kolorze fluorescencyjnym, a także identyfikacja autofluorescencji. Ponadto, wysoki sygnał do szumu obrazów można uzyskać za pomocą sondy o bardzo długiej żywotności w porównaniu do barwników fluorescencyjnych zwykle używane. Na przykład, koproporfiryna platyny ma żywotność rzędu milisekund, podczas gdy życia zwykłych barwników fluorescencyjnych są rzędu nanosekund. Takie stosunkowo długowieczne barwniki fluorescencyjne będą wkrótce wykorzystywane jako sondy do wykrywania DNA na chipach.
obrazowanie fluorescencyjne umożliwia również uzyskanie informacji o cząsteczkach podczas obserwacji żywej komórki. Czynniki wpływające na żywotność fluorescencji obejmują intensywność jonów, właściwości hydrofobowe, stężenie tlenu, Wiązanie molekularne i interakcję molekularną poprzez transfer energii, gdy dwa białka zbliżają się do siebie. Żywotność jest jednak niezależna od stężenia barwnika, fotobluszczania, rozpraszania światła i natężenia światła wzbudzającego. Dlatego też, fluorescencyjne obrazowanie żywotności pozwala nam na wykonanie dokładnego pomiaru stężenia jonów i analizy transferu energii rezonansowej fluorescencji (FRET).
istnieją dwie metody obrazowania życia fluorescencji: metoda domeny czasu i metoda domeny częstotliwości.
- time-domain FLIM – w niektórych przypadkach opóźnienia po wzbudzeniu przez laser impulsowy, obraz fluorescencyjny można uzyskać przez działanie bramki wzmacniacza obrazu. Żywotność jest mierzona w nanosekundach za pomocą lasera o czasie trwania impulsu kilkuset pikosekund i migawki na poziomie nanosekund, ponieważ żywotność stanu wzbudzenia wynosi zwykle od 1 do 20 nanosekund. Wzmacniacz obrazu High-speed Gate jest dostępny w handlu w firmie Hamamatsu Photonics K. K. (Hamamatsu, Japonia). Żywotność fluorescencji dla każdego piksela można również uzyskać przez pomiar, zmieniając czas opóźnienia, aż do otwarcia bramki. Fluorescencyjne obrazy życia są pokazywane w pseudokolorze zgodnie z ich żywotami.
- żywotność fluorescencji FLIM – domeny częstotliwości jest obliczana przez Pomiar przesunięcia fazowego fluorescencji i zmniejszenia jej amplitudy przy użyciu detektora z modulatorem wzmocnienia, gdy laser używany jako źródło światła wzbudzającego jest modulowany (1 do 200 megaherców). Pomiar może być wykonywany za pomocą skanowania laserowego (fotopowielacz) lub za pomocą urządzenia sprzężonego z ładunkiem (CCD).
Aplikacje
środowisko otaczające sondę jest wykrywane na podstawie faktu, że żywotność fluorescencji jest wrażliwa na stężenie jonów wodorowych (pH), tlenu i stężeń jonów wapnia. Wiązanie lub interakcja między cząsteczkami może być również mierzona w połączeniu z FRET.
obrazowanie stężenia jonów wapnia
gdy jon wapnia wiąże się z sondą fluorescencyjną, taką jak Fura-2, Fluo-3 lub zieleń wapniowa, zmienia się zarówno żywotność fluorescencji, jak i intensywność fluorescencji. Konwencjonalna procedura pomiaru stężenia jonów koncentruje się na zmianie intensywności. W zależności od zmiany stężenia jonu wapnia zmienia się stosunek barwników między związanym i niezwiązanym Jonem wapnia, co następnie prowadzi do zmiany okresu fluorescencji punktu pomiarowego w próbce. Oprócz sondy jonów wapnia technika ta ma również zastosowanie do pomiaru pH i innych jonów, takich jak Jon sodu i Jon magnezu.
Fluorescencyjny rezonansowy transfer energii (FRET)
badania są obecnie prowadzone na FRET przez zielone fluorescencyjne białko (GFP) warianty (GFP z innym kolorem fluorescencji). FRET umożliwia pomiar interakcji (asocjacji lub dysocjacji) między dwoma białkami, które są oznakowane parą barwników fluorescencyjnych. Barwnik fluorescencyjny dawcy ma krótsze długości fal wzbudzenia / emisji, które dostarczają energii do barwnika fluorescencyjnego akceptora. Żywotność stanu wzbudzenia barwnika dawcy jest zmienna w zależności od tego, czy istnieje akceptor (barwnik odbierający energię). Pomiar oparty na cyklu życia pozwala na lepszą kwantyfikację, ponieważ nie jest konieczne uwzględnianie nakładania się fluorescencji podczas wykrywania.
obrazowanie kliniczne
ponieważ niektóre próbki tkanek i cytodiagnostyki mają silną autofluorescencję, próbowano użyć sond o długiej żywotności (do milisekund). Sondy o długiej żywotności są również przydatne w hybrydyzacji fluorescencji in situ (FISH), ponieważ liczba kolorów, które mogą być używane jednocześnie, jest ograniczona tą techniką. Stężenie jonów wodorowych we krwi, jak również ciśnienie tlenu i dwutlenku węgla, zostały już zmierzone na podstawie okresu fluorescencji, chociaż takie pomiary nadal nie są możliwe w mikroskopie.
Zasoby Internetowe
- Centrum spektroskopii fluorescencyjnej-prowadzone przez profesora Józefa R. Lakowicz na Uniwersytecie Maryland, ta strona jest doskonałym źródłem informacji na temat fluorescencyjnego obrazowania życia i innych aspektów spektroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii.
- Kentech Instruments-Kentech produkuje wysokonapięciowe Generatory impulsów półprzewodnikowych i optyczne systemy obrazowania bramkowego do obrazowania fluorescencyjnego przez całe życie.
- Hamamatsu Photonics-oprócz doskonałej oferty systemów kamer cyfrowych, Hamamatsu produkuje również fotopowielacze, fotodiody lawinowe i wzmacniacze obrazu z szybkimi bramkami.
- PRS BioSciences – PRS Biosciences specjalizuje się w biologicznej mikroskopii fluorescencyjnej, produkuje aftermarket time-gated system, który może być dostosowany do wielu mikroskopów badawczych.
