10.4.2 trehaloza do kriokonserwacji komórek ssaków
kriokonserwacja jest powszechnie stosowana do konserwacji komórek przez dłuższy czas w ekstremalnie niskich temperaturach. Jednak zmiany fizyczne zachodzące podczas zamrażania i rozmrażania mogą być szkodliwe dla przetrwania i funkcji komórek. W związku z tym krioprotektanty muszą być dodawane do komórek podczas krioprezerwacji. Zastosowanie trehalozy jako krioprotektantu dla komórek wyłoniło się z założenia, że związki polihydroksylowe są wymagane po obu stronach błony komórkowej, aby komórki mogły być zachowane przez dłuższy czas . Trehaloza była badana przez kilka grup jako środek ochronny do kriokonserwacji różnych ludzkich komórek.
wprowadził trehalozę wraz z DMSO do komórek Langerhansa trzustkowego za pomocą termotropowego przejścia fazy ciekłej . Kriokonserwacja trehalozą spowodowała odzyskanie dorosłych wysepek w 92%, w porównaniu z odzyskaniem tylko 58% Po zastosowaniu samego DMSO. W przeszczepach z wysepek krioprezerwowanych trehalozą stwierdzono czternaście razy więcej insuliny niż w przeszczepach bez trehalozy. Odzyskiwanie klastrów komórek przypominających wysepki płodu (ICCs) krioprezerwowanych trehalozą wynosiło 94%, w porównaniu do tylko 42% u osób bez trehalozy. Po przeszczepieniu u nagich myszy obserwowano 15-krotne zwiększenie zawartości insuliny w przeszczepach z KRIOPREZERWOWANEGO ICC trehalozą. Wyniki te wskazują, że dodanie trehalozy jako środka krioprezerwacyjnego prowadzi do bardzo wysokiego wskaźnika przeżywalności ludzkiej tkanki endokrynnej trzustki.
Toner i współpracownicy wprowadzili niskie stężenia trehalozy do komórek ssaków za pomocą genetycznie zmodyfikowanej wersji białka tworzącego pory Alfa-hemolizyny i odkryli, że wewnątrzkomórkowa trehaloza może znacznie poprawić przeżywalność tych komórek podczas kriokonserwacji . Długoterminowe wskaźniki przeżycia po rozmrożeniu krioprezerwowanych fibroblastów mysich i ludzkich keratynocytów wynosiły odpowiednio 80% i 70%, przy wewnątrzkomórkowym stężeniu trehalozy 0,2 M. Stwierdzono również, że wewnątrzkomórkowa trehaloza ma korzystny wpływ na integralność błon wysuszonych komórek ssaków, przy czym ponad 90% odzysku nienaruszonej błony osocza obserwuje się po wysuszeniu i przechowywaniu komórek w łagodnych warunkach przez kilka tygodni .
wpływ trehalozy na kriokonserwację ludzkich hepatocytów był badany przez Katenz i wsp. . Komórki wątroby zamrożone w pożywce hodowlanej z 10% DMSO i 0,2 m trehalozą wykazały znaczną poprawę żywotności komórek po rozmrożeniu i wydajności poszycia w porównaniu z samym DMSO. Obecność trehalozy podczas kriokonserwacji powodowała również zwiększenie całkowitego poziomu białka w przyłączonych komórkach, wyższe poziomy wydzielania albumin i niższe poziomy aminotransferazy asparaginianowej po rozmrożeniu.
komórki macierzyste są ważnymi narzędziami do badania hematopoezy, opracowywania nowych strategii terapeutycznych, a także systemów modelowych dla niektórych chorób. Pomimo rozwoju kriokonserwacji, po rozmrożeniu komórki nadal pozostaje poważnym problemem. Martinetti et al. używana trehaloza do krioprezerwacji czystych macierzystych i progenitorowych komórek krwi obwodowej w celu zapobiegania utracie komórek, która występuje podczas normalnego przebiegu krioprezerwacji . Oceniono ekspresję powierzchniowego markera macierzystego CD34 i stwierdzono, że 1 m trehalozy zapewnia lepszą krioprotekcję komórek CD34+ o większej liczbie komórek i żywotności komórek w porównaniu ze standardową metodą zamrażania z użyciem DMSO. Ponadto kriokonserwacja trehalozą przez krótsze i dłuższe okresy zachowała zdolność komórek CD34+ do różnicowania się w komórki megakariopoetyczne po rozmrożeniu. Wyniki te sugerują zdolność trehalozy do zachowania żywotności i funkcji komórek macierzystych, gdy jest stosowana jako krioprotektant.
długotrwałe przechowywanie czerwonych krwinek (RBC) i płytek krwi przy jednoczesnym zachowaniu wysokiego stopnia żywotności ma istotne znaczenie w transfuzji krwi i medycynie klinicznej. Satpathy i in. opisano sposób ładowania RBC trehalozą ze środowiska zewnątrzkomórkowego za pomocą nierównowagi osmotycznej i przejścia fazowego fosfolipidów, w wyniku którego wewnątrzkomórkowe stężenia trehalozy wynosiły 40 mM . Stwierdzono, że trehaloza wywiera osmotyczną ochronę RBC przez dłuższy czas. Liofilizacja RBC obciążonych trehalozą, a następnie ponowne nawodnienie spowodowało 55% przeżycia z zachowaniem ich morfologii. Przetrwałe komórki syntetyzowały ATP i 2,3-difosfoglicerynian (DPG) i miały niski poziom methemoglobiny. Aktywność SOD i katalazy oraz drugorzędowa struktura hemoglobiny w liofilizowanych RBC były bardzo podobne do tych w świeżych RBC. Badanie to wykazało, że obciążenie trehalozą było wymagane do stabilizacji hemoglobiny i stanowiło ważny krok w kierunku kriokonserwacji RBC.
normalny czas przechowywania płytek krwi ludzkiej w bankach krwi wynosi 5 dni, po czym są one odrzucane, co powoduje przewlekły niedobór płytek wymaganych do przetoczenia krwi. Jako wysiłek w kierunku krioprezerwacji płytek krwi przez dłuższy czas, Wolkers et al. opisał sposób wprowadzania trehalozy do cytoplazmy ludzkich płytek krwi . Stwierdzono, że trehaloza jest łatwo wchłaniana przez ludzkie płytki krwi w temperaturze 37°C z wydajnością ładowania większą niż 50%. Liofilizacja i ponowne nawodnienie płytek obciążonych trehalozą skutkowało znakomitym odzyskiwaniem nienaruszonych płytek przy współczynniku przeżycia wynoszącym 85%. Płytki te reagowały w prawie identyczny sposób jak świeże płytki na agonistów, takich jak trombina, ADP, kolagen i ristocetyna. Mikrodomeny membranowe i składniki białkowe płytek obciążonych trehalozą utrzymywano w stanie nienaruszonym po liofilizacji i ponownym nawodnieniu.
wykazano również ochronne działanie trehalozy w komórkach nabłonka rogówki. Preinkubacja hodowanych komórek nabłonka rogówki trehalozą, a następnie suszenie spowodowało znaczne zmniejszenie odsetka martwych komórek w porównaniu z pożywką kontrolną . Działanie ochronne potwierdzono również ex vivo w wyłuskanych oczach świń, w których tkanka inkubowana z trehalozą była wyraźnie gładsza . Wyniki te wskazują na przydatność trehalozy w okulistyce i jej potencjalne zastosowanie jako kropli do oczu w zespole suchego oka.
zastosowanie trehalozy do kriokonserwacji organelli zostało wykazane przez Yamaguchi i wsp., którzy używali trehalozy jako krioprotektantu dla zamrożonych mitochondriów . Mitochondria zamrożone w obecności trehalozy wykazywały integralność mitochondrialnej błony zewnętrznej (MOM) i zdolność reagowania na białka z rodziny Bcl-2 podobną do tych ze świeżych mitochondriów. W obecności trehalozy zachowano również ultrastrukturę, syntezę ATP, potencjał przezbłonowy, obrzęk wywołany wapniem oraz import i przetwarzanie białek prekursorowych. Jest to w przeciwieństwie do standardowego buforu sacharozowo-mannitolowego stosowanego do zamrażania mitochondriów, które często stają się nieszczelne. W ten sposób trehaloza była w stanie zachować większość cech biologicznych mitochondriów, a zamrożone w trehalozie mitochondria mogą być wykorzystywane do badań nad apoptozą i innymi funkcjami mitochondriów, które opierają się na integralności matki.
trehaloza była stosowana do konserwacji narządów przez dłuższy czas. „Rozwiązanie ET-Kyoto” zostało opracowane przez grupę Wada w celu zachowania psich płuc przez >30 godzin bez wpływu na wydajność komórek śródbłonka i unaczynienia . Za pomocą trehalozy uzyskano również długotrwałą stabilizację i konserwację szczepionek i przeciwciał.
