Metody oczyszczania białek: 4 metody

Ten artykuł rzuca światło na cztery metody oczyszczania białek.

cztery metody oczyszczania białek to: (1) ekstrakcja (2) wytrącanie i różnicowa Solubilizacja (3) Ultracentryfugacja i (4)metody chromatograficzne.

metody stosowane w oczyszczaniu białek można z grubsza podzielić na metody analityczne i preparatywne.

różnica nie jest dokładna, ale decydującym czynnikiem jest ilość białka, którą można praktycznie oczyścić tą metodą. Metody analityczne mają na celu wykrycie i identyfikację białka w mieszaninie, podczas gdy metody preparatywne mają na celu wytwarzanie dużych ilości białka do innych celów, takich jak Biologia strukturalna lub zastosowanie przemysłowe. Ogólnie rzecz biorąc, metody preparatywne mogą być stosowane w aplikacjach analitycznych, ale nie na odwrót.

Metoda # 1. Ekstrakcja:

w zależności od źródła, białko musi zostać doprowadzone do roztworu przez rozbicie tkanki lub komórek ją zawierających. Istnieje kilka metod, aby to osiągnąć; wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie, sonikacja, homogenizacja pod wysokim ciśnieniem lub przenikanie rozpuszczalnikami organicznymi. Metoda wyboru zależy od tego, jak kruche jest białko i jak wytrzymałe są komórki.

po tym procesie ekstrakcji rozpuszczalne białko będzie w rozpuszczalniku i może być oddzielone od błon komórkowych, DNA itp. przez odwirowanie. Proces ekstrakcji ekstrahuje również proteazy, które rozpoczną trawienie białek w roztworze. Jeśli białko jest wrażliwe na proteolizę, zwykle pożądane jest szybkie działanie i utrzymywanie ekstraktu w stanie schłodzonym, aby spowolnić proteolizę.

Metoda # 2. Wytrącanie i różnicowa Rozpuszczalność:

w oczyszczaniu masowym białek częstym pierwszym etapem izolowania białek jest wytrącanie siarczanem amonu (NH4)2SO4. Odbywa się to przez dodanie coraz większej ilości siarczanu amonu i zbieranie różnych frakcji białka osadu. Jedną z zalet tej metody jest to, że można ją wykonać niedrogo przy bardzo dużych ilościach.

pierwsze białka do oczyszczenia są rozpuszczalne w wodzie. Oczyszczanie integralnych białek błonowych wymaga przerwania błony komórkowej w celu wyizolowania jednego konkretnego białka od innych, które znajdują się w tym samym przedziale membranowym. Czasami szczególna trakcja błonowa może być najpierw wyizolowana, na przykład izolacja mitochondriów z komórek przed oczyszczeniem białka znajdującego się w błonie mitochondrialnej.

detergent, taki jak dodecylosiarczan sodu (SDS), może być stosowany do rozpuszczania błon komórkowych i utrzymywania białek błonowych w roztworze podczas oczyszczania; Jednakże, ponieważ SDS powoduje denaturację, łagodniejsze detergenty, takie jak Triton X-100 lub CHAPS, mogą być stosowane do zachowania natywnej konformacji białka podczas oczyszczania.

Metoda # 3. Ultracentryfugacja:

odwirowanie jest procesem, który wykorzystuje siłę odśrodkową do oddzielania mieszanin cząstek o różnych masach lub gęstościach zawieszonych w cieczy. Gdy naczynie (zazwyczaj rurka lub butelka) zawierające mieszaninę białek lub innych cząstek stałych, takich jak komórki bakteryjne, obraca się z dużą prędkością, moment obrotowy daje siłę zewnętrzną każdej cząstki, która jest proporcjonalna do jej masy.

tendencja danej cząstki do poruszania się przez ciecz z powodu tej siły jest równoważona przez opór, jaki ciecz wywiera na cząstkę. Efekt netto „wirowania” próbki w wirówce polega na tym, że masywne, małe i gęste cząstki poruszają się na zewnątrz szybciej niż mniej masywne cząstki lub cząstki o większym „przeciągnięciu” w cieczy.

gdy zawiesiny cząstek są „wirowane” w wirówce, na dnie naczynia może powstać „Śrut”, który jest wzbogacany dla najbardziej masywnych cząstek o niskim oporze cieczy. Pozostałe, nieskompaktowane cząstki nadal pozostające głównie w cieczy nazywane są” supernatantem ” i mogą być usunięte z naczynia w celu oddzielenia supernatantu od granulatu.

szybkość wirowania jest określona przez Przyspieszenie kątowe przykładane do próbki, zwykle mierzone w porównaniu do g. jeśli próbki są odwirowywane wystarczająco długo, cząstki w naczyniu osiągną równowagę, w której cząstki gromadzą się konkretnie w punkcie naczynia, w którym ich gęstość wyporu jest zrównoważona siłą odśrodkową. Taka” równowagowa ” Wirówka może pozwolić na szerokie oczyszczenie danej cząstki.

odwirowanie gradientu sacharozy:

liniowy gradient stężenia cukru (zwykle sacharozy glicerolu lub Perkollu) jest generowany w probówce w taki sposób, że najwyższe stężenie znajduje się na dole, a najniższe na górze. Próbka białka jest następnie warstwowana na gradiencie i obracana z dużą prędkością w ultracentrifuge. Powoduje to, że ciężkie makrocząsteczki migrują w kierunku dna rury szybciej niż lżejszy materiał.

podczas wirowania przy braku sacharozy, gdy cząstki poruszają się coraz dalej od środka obrotu, doświadczają coraz większej siły odśrodkowej (im dalej się poruszają, tym szybciej się poruszają). Problem polega na tym, że użyteczny zakres separacji wewnątrz statku jest ograniczony do małego obserwowalnego okna.

obracanie próbki dwa razy dłużej nie oznacza, że interesująca cząstka zajdzie dwa razy dalej; w rzeczywistości zajdzie znacznie dalej. Jednak gdy białka poruszają się przez gradient sacharozy, napotykają ciecz o rosnącej gęstości i lepkości.

odpowiednio zaprojektowany gradient sacharozy przeciwdziałać będzie rosnącej sile odśrodkowej, więc cząstki poruszają się w bliskiej proporcji do czasu, w którym znajdowały się w polu odśrodkowym. Próbki oddzielone takimi gradientami określa się jako odwirowanie „strefowe”. Po oddzieleniu białka/cząstek gradient jest następnie frakcjonowany i gromadzony.

metoda # 4. Metody chromatograficzne:

Zwykle protokół oczyszczania białka zawiera jeden lub więcej etapów chromatograficznych. Podstawową procedurą w chromatografii jest przepływ roztworu zawierającego białko przez kolumnę wypełnioną różnymi materiałami. Różne białka różnie oddziałują z materiałem kolumny, a zatem mogą być oddzielone przez czas wymagany do przejścia kolumny lub warunki wymagane do wymywania białka z kolumny. Zwykle białka są wykrywane, gdy wychodzą z kolumny przez ich absorbancję przy 280 nm.

istnieje wiele różnych metod chromatograficznych:

1. Chromatografia wykluczająca rozmiar:

chromatografia może być stosowana do oddzielania białka w roztworze lub w Warunkach denaturacji za pomocą porowatych żeli. Technika ta jest znana jako chromatografia wykluczająca rozmiar. Zasada jest taka, że mniejsze cząsteczki muszą przemierzać większą objętość w porowatej matrycy. W konsekwencji, białka o pewnym zakresie wielkości będą wymagały zmiennej objętości eluantu (rozpuszczalnika) przed zebraniem na drugim końcu kolumny żelu.

w kontekście oczyszczania białka eluant jest zwykle gromadzony w różnych probówkach. Wszystkie probówki nie zawierające mierzalnego śladu białka do oczyszczenia są odrzucane. Pozostały roztwór składa się więc z białka do oczyszczenia i wszelkich innych białek o podobnej wielkości.

2. Chromatografia jonowymienna:

chromatografia jonowymienna oddziela związki zgodnie z naturą i stopniem ich ładunku jonowego. Kolumna, która ma być użyta, jest wybierana w zależności od jej rodzaju i siły ładunku. Żywice anionowymienne mają ładunek dodatni i służą do zatrzymywania i oddzielania ujemnie naładowanych komarów, podczas gdy żywice kationowymienne mają ładunek ujemny i służą do oddzielania dodatnio naładowanych cząsteczek.

przed rozpoczęciem separacji bufor jest pompowany przez kolumnę w celu zrównoważenia przeciwległych naładowanych jonów. Po wstrzyknięciu próbki rozpuszczone cząsteczki wymieniają się z jonami buforowymi, ponieważ każda z nich konkuruje o miejsca wiązania na żywicy. Długość retencji dla każdej substancji rozpuszczonej zależy od siły jej ładunku.

najsłabiej naładowane związki najpierw wymyją, a następnie te z kolejno silniejszymi ładunkami. Ze względu na charakter mechanizmu oddzielającego, pH, Typ bufora, stężenie bufora i temperatura odgrywają ważną rolę w kontrolowaniu separacji. Chromatografia jonowymienna jest bardzo potężnym narzędziem do stosowania w oczyszczaniu białek i jest często stosowana zarówno w separacjach analitycznych, jak i preparatywnych.

3. Chromatografia Powinowactwa:

chromatografia powinowactwa jest techniką separacji opartą na konformacji molekularnej, która często wykorzystuje specyficzne dla aplikacji żywice. Żywice te mają ligandy przymocowane do ich powierzchni, które są specyficzne dla związków, które mają być oddzielone. Najczęściej te ligandy działają w sposób podobny do interakcji przeciwciało-antygen. To dopasowanie „zamka i klucza” między ligandem a jego docelowym Związkiem sprawia, że jest on wysoce specyficzny, często generując pojedynczy pik, podczas gdy cała reszta w próbce nie jest zachowana.

wiele białek błonowych jest glikoproteinami i można je oczyszczać metodą chromatografii powinowactwa lektynowego. Rozpuszczone w detergencie białka można pozostawić do wiązania z żywicą chromatograficzną, która została zmodyfikowana, aby miała kowalencyjnie dołączoną lektynę.

białka, które nie wiążą się z lektyną, są zmywane, a następnie specyficznie związane glikoproteiny mogą być eluowane przez dodanie wysokiego stężenia cukru, który konkuruje z powiązanymi glikoproteinami w miejscu wiązania lektyny. Niektóre lektyny mają wysokie powinowactwo do oligosacharydów glikoprotein, które trudno konkurować z cukrami, a związane glikoproteiny muszą być uwalniane przez denaturowanie lektyny.

4. Wiązanie metali:

powszechna technika polega na inżynierii sekwencji 6 do 8 histydyn w C-terminalu białka. Polihystydyna wiąże się silnie z dwuwartościowymi jonami metali, takimi jak nikiel i kobalt. Białko może być przepuszczane przez kolumnę zawierającą unieruchomione jony niklu, które wiążą znacznik polihystydyny. Wszystkie nietagowane białka przechodzą przez kolumnę.

białko można eluować imidazolem, który konkuruje z znacznikiem polihystydyny o wiązanie z kolumną, lub przez zmniejszenie pH (zazwyczaj do 4,5), co zmniejsza powinowactwo znacznika do żywicy. Podczas gdy procedura ta jest zwykle stosowana do oczyszczania rekombinowanych białek o zmodyfikowanym znaczniku powinowactwa (takim jak znacznik 6xHis lub znacznik HAT Clontech), może być również stosowana do naturalnych białek o wrodzonym powinowactwie dwuwartościowych kationów tor.

5. Chromatografia Immunoaffinity:

chromatografia Immunoaffinity wykorzystuje specyficzne wiązanie przeciwciała z docelowym białkiem do selektywnego oczyszczania białka. Procedura polega na unieruchomieniu przeciwciała do materiału kolumnowego, który następnie selektywnie wiąże białko, podczas gdy Wszystko inne przepływa przez. Białko może być eluowane przez zmianę pH lub zasolenia. Ponieważ ta metoda nie obejmuje inżynierii w znaczniku, może być stosowana do białek ze źródeł naturalnych.

6. HPLC:

Wysokosprawna chromatografia cieczowa lub wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa jest formą chromatografii z zastosowaniem wysokiego ciśnienia w celu szybszego przepchnięcia substancji rozpuszczonych przez kolumnę. Oznacza to, że dyfuzja jest ograniczona, a Rozdzielczość poprawiona. Najczęstszą formą jest” faza odwrócona ” HPLC, w której materiał kolumny jest hydrofobowy.

białka są eluowane przez gradient rosnących ilości rozpuszczalnika organicznego, takiego jak acetonitryl. Białka eluują się zgodnie z ich hydrofobowością. Po oczyszczeniu za pomocą HPLC białko jest w roztworze, który zawiera tylko lotne związki i może być łatwo liofilizowany. Oczyszczanie HPLC często prowadzi do denaturacji oczyszczonych białek i dlatego nie ma zastosowania do białek, które nie ulegają samoistnemu odkładaniu.