Molekularne wykrywanie toxigenic C difficile: Gen toksyny A czy B?

zakażenia Clostridium difficile (CDIs) są główną przyczyną nabytej w szpitalu biegunki, głównie dotykającej pacjentów narażonych na antybiotyki. Zakażenia były związane z długotrwałymi pobytami w szpitalu i znacznymi kosztami opieki zdrowotnej. Ostatnie zmiany w epidemiologii CDI obejmują zwiększoną częstość występowania i nasilenie choroby, częściowo ze względu na pojawienie się szczepu (BI/NAP1 / 027), który jest obecnie endemiczny w wielu amerykańskich szpitalach.1 klinicyści obserwowali również zwiększoną liczbę zakażeń w populacjach wcześniej niskiego ryzyka oraz przypadki CDI nabytych we Wspólnocie, przy braku tradycyjnych czynników ryzyka.

tylko produkujące toksyny szczepy C powodują choroby, a toksyny A i B (kodowane przez geny tcdA i tcdb) wydają się odgrywać ważną rolę. Toksyny są prozapalnymi enterotoksynami, ale Toksyna B jest silniejszą cytotoksyną.2 bezpośrednią cytotoksyczność kału, która wykrywa toksynę B, był pierwszym klinicznie użytecznym testem diagnostycznym, który został opracowany. Na początku lat 90. opracowano szybkie enzymatyczne testy immunologiczne (EIAs) w celu wykrycia toksyny a, która jest bardziej immunogenna niż Toksyna B. wiele laboratoriów przyjęło te testy, ponieważ były wygodne i łatwiejsze w użyciu.

w 2000 r.wybuchy ciężkich przypadków CDI wywołanych szczepami, które nie mają wariantów toksyny A (A-B+), były pierwszą wskazówką, że toksyna A nie jest niezbędna w chorobie klinicznej.3,4 pacjentów z CDI, u których zastosowano te szczepy wariantowe, błędnie zdiagnozowano, ponieważ ich próbki kału były ujemne pod wpływem toksycznych oddziaływań Oias specyficznych dla toksyny A.3 w przypadku braku odpowiedniego leczenia u niektórych pacjentów wystąpiły ciężkie powikłania CDI o słabych wynikach, w tym śmierć.3,4 w odpowiedzi na pojawienie się szczepów różniących się toksyną a-ujemną odmianą C producenci kit opracowali nowe EIA, które wykryły również toksynę B, ponieważ samo wykrywanie toksyny a nie było już dopuszczalne.

większość chorobotwórczych toksyn C wytwarza obie toksyny. Szczepy toksyn A-B+ stanowią jednak od 2% do 11% przypadków CDI5, z wyższymi szacunkami w Irlandii6 i Azji.7 szczepy te, które charakteryzują się dużymi delecjami w genie tcdA, powodują to samo spektrum choroby, co te produkujące obie toksyny, od łagodnej biegunki do rzekomobłoniastego zapalenia jelita grubego.Niektóre doniesienia sugerują jednak, że choroba wywołana przez szczepy toksyn A-B+ jest bardziej prawdopodobna.7

natomiast doniesienia o naturalnie występujących szczepach chorobotwórczych, które nie wytwarzają toksyny B (warianty toksyny A+B) są niezwykle rzadkie. Jedynym doniesieniem w literaturze o zakażeniu szczepem A + B był pacjent z nawracającą CDI, od którego wcześniej izolowano Izolaty C diff zawierające zarówno geny tcdA, jak i tcdb.8 próbek kału pobranych od pacjenta podczas wcześniejszych epizodów biegunki wykazało obecność toksyny B W teście cytotoksyczności. Badanie szczepu A + B z trzeciego epizodu wykazało całkowity brak genu tcdB lub innych genów niezbędnych do produkcji toksyn i delecję w genie tcdA.Ponadto Wariant A+B nie wytwarzał ani toksyny A, ani toksyny B in vitro, kwestionując jej znaczenie jako przyczyny objawów u pacjenta.

zdolność do genetycznego tworzenia różnic C, które wytwarzają tylko toksyny a (A+B – mutanty) lub toksyny B (A-B+ mutanty) i infekują wrażliwe chomiki mutantami, doprowadziła do dwóch badań nad indywidualnym znaczeniem tych toksyn w procesie chorobowym. W jednym z badań autorzy doszli do wniosku, że toksyna B jest niezbędna w chorobie, podczas gdy Toksyna a nie jest wymagana.W drugim badaniu wykazano, że toksyna może wywoływać choroby, ale zmutowane szczepy wytwarzające samą toksynę B powodowały poważniejszą chorobę.Chociaż oba badania wydają się być sprzeczne ze sobą, ustalenia Lyras i wsp. są bardziej zgodne z tym, co zaobserwowano w dotychczasowej praktyce klinicznej, ponieważ wszystkie klinicznie istotne szczepy różnicujące C (w tym warianty A+B+ I A-B+) wytwarzają toksynę B i brak naturalnie występujących szczepów chorobotwórczych, które wytwarzają tylko toksynę A.

badania laboratoryjne w celu wykrycia toksycznych różnic C w celu potwierdzenia diagnozy CDI u pacjentów pozostają wyzwaniem ze względu na wydajność powszechnie stosowanych toksyn A/B EIAs lub czasy realizacji dla bardziej wrażliwych metod, takich jak hodowla toksyn.Szybkie testy molekularne na obecność toksycznych różnic C znacząco poprawiły dokładność, z jaką pacjenci z CDI mogą być diagnozowani i leczeni. Dzięki wiarygodnym właściwościom wrażliwości i specyficzności dla kultury toksygenowej, klinicyści mogą ufać wynikami laboratoryjnymi, które potwierdzają ich kliniczne podejrzenie CDI lub wykluczają różnice C jako źródło objawów pacjenta. Zgodnie z nowymi wytycznymi SHEA / IDSA (Society for Healthcare Epidemiology of America and Infectious Diseases Society of America) dotyczącymi praktyki klinicznej dla CDI u dorosłych, testy PCR wydają się być szybkie, wrażliwe i specyficzne, a ostatecznie mogą rozwiązać problemy z testami.12

wszystkie testy FDA-cleared real-time polymerase chain reaction, lub PCR, celują w Gen toksyny B (tcdb). Wybór tcdb jako celu molekularnego jest idealny z kilku powodów: zasadnicza rola toksyny B w procesie chorobowym10, 11; obecność toksyny B i tcdb we wszystkich szczepach wywołujących chorobę; oraz dowody na to, że wykrywanie tcdB u pacjentów z objawami dobrze koreluje z dokładną diagnozą CDI.

uzasadnienie dla innych celów, takich jak gen tcdA, jest mniej jasne. Wiele szczepów różniących się wariantem A-B+ C ma delecje w genach toksyny A14 i może nie być wiarygodnych jako cel. W przeciwieństwie do genu tcdB, brakuje badań wykazujących,że wykrywanie tcda koreluje z chorobą kliniczną; a ponieważ gen może być również znaleziony sam w szczepach nie powodujących choroby, 15 wykrycie tcdA może potencjalnie prowadzić do błędnej diagnozy CDI.

diagnoza CDI wymaga połączenia objawów klinicznych i dokładnego wykrycia toksynowego różnicowania C w stolcu pacjenta z objawem.Przy odpowiednim stosowaniu i ograniczeniu do pacjentów z objawami choroby klinicznej, testy PCR ukierunkowane na gen tcdB mogą ułatwić dokładną diagnozę CDI, co z kolei może prowadzić do lepszego postępowania z pacjentem poprzez odpowiednią terapię i szybkie wdrożenie środków kontroli zakażeń.

Diane Kawa, PhD, SM(ASCP),
jest dyrektorem ds. naukowych w BD w Franklin Lakes, NJ.