Budowa Mito-jądrowych linii introgresji
aby wyizolować genetyczne efekty mtDNA z genomu jądrowego, nasze eksperymenty opierały się na mitonuklearnych liniach introgresji (MNILs). Budowa naszych MNILs jest szczegółowo wyjaśniona w Kurbalija Novicic et al. . Krótko mówiąc, wszystkie używane MNILs zostały utworzone z linii izofemale (IFLs), z których każda została założona przez pojedynczą, zebraną dziko matkę pochodzącą ze wspólnej pojedynczej naturalnej populacji (Wąwóz Siczewo-Serbia, S 43°19’55.58″ N 22°0837.98″). Linie zostały najpierw genotypowane dla ich haplotypu mtDNA przy użyciu enzymów restrykcyjnych i wybraliśmy sześć IFL, z których trzy nosiły haplotypy HI i trzy haplotypy HII, z których każdy był następnie krzyżowany wstecznie wspólnym siódmym IFL („D”). W każdym MNL backcrossing wykonywano łącząc 10 dziewiczych samic z danego IFL z 20 samcami z linii D. Zastosowaliśmy tę powtarzającą się introgresywną procedurę krzyżowania wstecznego przez 12 kolejnych pokoleń, aby zastąpić Genom jądrowy danego IFL wspólnym wyhodowanym genomem jądrowym d (> zastąpiono 99,95%). Zauważ, że IFL nie były inbredowe lub w inny sposób wykonane izogeniczne. Aby wykluczyć możliwość zanieczyszczenia podczas introgresji, integralność mtDNA wszystkich Mnil zatwierdzono w pokoleniu 5, 8 i 12 poprzez genotypowanie próbki much z każdego MNIL. Zbadaliśmy również obecność Wolbachii we wszystkich MNILs, metodą PCR z użyciem starterów specyficznych dla Wolbachii 16S rDNA przy użyciu metod wyszczególnionych w García-Martínez et al. . Jako pozytywne kontrole wykorzystaliśmy dwa różne szczepy Drosophila zawierające Wolbachia (D. melanogaster stock no. 5, Bloomington Stock Centre, D. simulans, Riverside szczep). Te testy PCR były ujemne dla wszystkich naszych MNILs, jak również dla linii D. Wszystkie linie zostały utrzymane i wszystkie eksperymenty przeprowadzono w stałych warunkach laboratoryjnych, w temperaturze 19 °C, 60% wilgotności względnej, świetle 300 lx i przy fotoperiodzie 12 h Światła: 12 h ciemności.
założenie eksperymentalnej populacji ewolucyjnej
przed eksperymentami połączyliśmy trzy Mnile przenoszące HI w jedną populację źródła HI i trzy Mnile HII w populację źródła hii, aby ujednolicić potencjalną jądrową zmienność genetyczną w MNILs. Dokonano tego poprzez zmieszanie 100 dorosłych much z każdego MNL, w dwóch klatkach populacji (tj., N = 3 × 100 much Na Klatkę) (klatki z pleksiglasu, dł. 25 cm x szer. 15 cm x wys.15 cm, z 3 naczyniami zawierającymi po 30 ml mąki kukurydzianej) i utrzymywanie ich przez kolejne pełne pokolenie w standardowych warunkach laboratoryjnych. W ten sposób dwie populacje źródłowe nosiły haplotyp HI lub hii mtDNA, wyrażony w wyhodowanym i wspólnym jądrowym tle genetycznym (tj. D). Dziewicze muchy z tych dwóch populacji źródłowych zostały następnie wyodrębnione i użyte do znalezienia eksperymentalnych populacji ewolucyjnych.
zainicjowaliśmy N = 12 eksperymentalnych populacji ewolucyjnych. W każdej populacji N = 100 dziewiczych much (stosunek płci 1:1) w wieku 3-5 dni zostało wprowadzonych z populacji źródłowych do klatki populacyjnej (L25 cm x W15 cm xH15 cm). Zmieniliśmy początkową częstotliwość haplotypów HI i HII oraz warunki dotyczące zasobów żywności w populacjach, stosując schemat krzyżowania 2 × 2 (N = 3 populacje na komórkę) w następujący sposób. W połowie klatek 80% much założycielskich pochodziło z populacji HI source, a 20% z populacji hii source. W drugiej połowie 20% much założycielskich pochodziło z populacji HI source, a 80% z populacji hii source. Pod względem zasobów żywności, ilość pożywki (zarówno objętościowo, jak i powierzchniowo) była identyczna w obu badanych grupach, podczas gdy w populacji zmienność stężenia składników odżywczych była manipulowana w następujący sposób. Połowa klatek (homogeniczne warunki pokarmowe) zawierała 3 identyczne dania, z których każda po 30 ml standardowego pożywki kukurydzianej (YC) zawierającej 1,5% drożdży. Druga połowa klatek (niejednorodne warunki pokarmowe) również zawierała 3 naczynia po 30 ml pożywki standardowej, ale różniły się one stężeniem drożdży (YL-0,375%, YC – 1,5%, YH – 6%).
utrzymanie eksperymentalnych populacji ewolucyjnych
populacje utrzymywano w laboratorium w sposób zapewniający oddzielne pokolenia, 40 dni/cykl , w temperaturze 19 °C, 60% wilgotności Względnej i 12 h Światła: 12 h ciemnego cyklu. W dniu 40 trzy stare potrawy zostały zastąpione przez trzy nowe, a muchy zostały dopuszczone w sumie 9 dni na oviposition . Nowe naczynia, zawierające jaja i larwy, zostały następnie oczyszczone z wszelkich dorosłych i przeniesione do nowej klatki, aby rozpocząć następne pokolenie. Wszystkie dorosłe muchy w każdej starej klatce były następnie liczone, gdy były martwe.
sekwencjonowanie i zespoły mitogenomów
przed oszacowaniem częstotliwości haplotypu (patrz poniżej) zsekwencjonowaliśmy i zmontowaliśmy wszystkie używane haplotypy mtDNA. DNA ekstrahowano z sześciu linii IF (HI: 1, 3, 5; HII: 21, 25, 29) używanych do tworzenia MNILs, stosując protokół wytrącania soli z etanolem. Muchy najpierw delikatnie macerowano i umieszczano w buforze przygotowawczym (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH = 8,0, 0,5% SDS) wraz z proteinazą K, wirowano i inkubowano w temperaturze 50 °C przez noc. Próbki następnie zamrażano przez noc. Aby wytrącić DNA, dodaliśmy nasycony NaCl kilka razy przed dodaniem 95% etanolu, i obróciliśmy DNA w granulkę. Osad DNA zawieszono w buforze TE 4 (pH = 7,6). Jakość i ilość DNA oceniano za pomocą Nanodropu, Kubitu i Bioanalizatora, a następnie oceniano długość fragmentu na żelu agarozowym.
Biblioteki sekwencjonowania zostały przygotowane ze 100 ng DNA przy użyciu zestawu TruSeq PCRfree DNA Library preparation kit. Sześć próbek następnie zsekwencjonowano do 125 bp sparowanych odczytów końcowych w dwóch pasach na systemie Illumina HiSeq2500 przy użyciu chemii sekwencjonowania v4. W sumie zsekwencjonowaliśmy średnio 194 miliony czytań dla każdej biblioteki. Mitogenomy z sześciu próbek zostały następnie zmontowane przy użyciu 5% podzbioru całkowitej liczby odczytów z każdej biblioteki. Odczyty były zasilane algorytmem MITObim V 1.8 i MIRA V 4.0.2 assembler, do wykonywania zespołów kierowanych, przy użyciu Mitogenomu Drosophila pseudoobscura (GenBank: Fj899745.1) jako genomu referencyjnego. Wszystkie uzyskane zespoły były okrągłymi mitogenomami o wielkości prawie 16kbp. Końcowe zespoły zostały następnie wyrównane za pomocą ClustalW i MAFFT i ręcznie dobrane, aby uzyskać ostateczny wypolerowany montaż dla każdego haplotypu. Zmontowane mitogenomy były adnotowane przy użyciu DOGMA i MITOS, przy użyciu domyślnych ustawień parametrów, a na koniec ręcznie kuratorowane.
aby ocenić ważność naszego zespołu mitogenomów, wszystkie sekwencje mtDNA Drosophila subobscura dostępne na GenBank (Cox1, COX2, cox3, Cob, Nad1, Nad2, Nad3, Nad5, rrnL, rrns, region bogaty w A + T i kilka trna), łącznie obejmujące ponad 50% całego zespołu, zostały wyrównane z naszymi mitogenomami. Bez wyjątku wykazywały one > 99% identyczności sekwencji.
w każdym z sześciu haplotypów mitogenomu (patrz poniżej) znaleziono kilka unikalnych SNP, z których dwa konsekwentnie rozróżniały grupy haplotypów HI i HII. Głębokość pokrycia dla każdego SNP została zweryfikowana przez odwzorowanie odczytów używanych do montażu mitogenomu przy użyciu Bowtie v 1.2 . Wysiłki te potwierdziły wszystkie SNP zidentyfikowane na etapie montażu. Tutaj skupiamy się na dwóch głównych grupach haplotypów I I II, które wykazują uderzający i spójny wzór polimorfizmu wewnątrz populacji w populacjach (rys. 1) i funkcjonalne różnice fenotypowe (patrz wstęp). Chociaż SNP występują w każdej z dwóch grup haplotypów, takie SNP są rzadkie (np. ) i nie są konsekwentnie polimorficzne.
oszacowanie częstotliwości haplotypu mtDNA
użyliśmy pool-seq do oszacowania ewolucji częstotliwości haplotypu, poprzez sekwencjonowanie próbek much z 5. i 10. generacji każdej eksperymentalnej populacji ewolucyjnej. W każdej próbce zebrano 105 losowo wybranych much na klatkę i poddano ekstrakcji DNA (w grupach po 15) oraz sekwencjonowaniu preparatów bibliotecznych, jak opisano powyżej. N = 24 próbki następnie zsekwencjonowano do 125 bp sparowanych odczytów końcowych w dwóch pasach na systemie Illumina HiSeq2500, przy użyciu chemii sekwencjonowania v4. Nasz wysiłek pool-seq został zaprojektowany w celu zapewnienia wystarczającej głębokości sekwencjonowania do dokładnego oszacowania częstotliwości haplotypu mtDNA, ale nie pozwala na szczegółowe analizy genomu jądrowego.
zsekwencjonowaliśmy średnio 66 milionów czytań dla każdej biblioteki. Odczyty z każdej biblioteki były następnie mapowane z powrotem do sześciu zmontowanych mitogenomów, zachowując tylko unikalne i zerowe odwzorowania przy użyciu Bowtie v 1.2 . Liczba odczytów mapowanych do dwóch SNP, które odróżniały typy HI I HII (w Nad5 i w 12S rRNA), została następnie policzona i wykorzystana jako oszacowanie względnej częstotliwości każdego głównego haplotypu (HI lub HII) w każdej próbce.
analizy statystyczne
dla każdej próbki wszystkie odczyty mapowane do dwóch diagnostycznych SNP (patrz poniżej) były liczone jako typu HI lub typu HII. Odsetek odczytów HI dla dwóch różnych SNP był bardzo ściśle skorelowany w 24 próbkach (r = 0,987), tak że oba markery dostarczyły praktycznie identycznych szacunków. Tutaj użyliśmy średniej proporcji w obu SNP, aby oszacować częstotliwość HI obecną w każdej próbce pool-seq.
ewolucję można zdefiniować jako zmiany częstotliwości genotypu w populacji, a nasz projekt pozwolił nam na wyprowadzenie dwóch czasowo oddzielonych powtarzanych miar zmian częstotliwości haplotypu na pokolenie w każdej rozwijającej się linii jako Δf0–5 = (f5 – f0)/5 lub Δf5–10 = (f10 – f5)/5, gdzie indeksy dolne oznaczają generację, w której pobrano próbkę. Ponadto oszacowano Δf0–10 = (f10 – f0)/10, aby ocenić zmianę częstotliwości haplotypu netto. Ponieważ tylko dwa genotypy były zaangażowane, częstotliwość HI: fI = 1-fII, a tym samym ograniczamy nasze analizy do zmian częstości jednego z haplotypów. Dla każdego oszacowania Δf otrzymaliśmy również zależny od częstotliwości współczynnik selekcji (SI) odpowiadający sile selekcji wymaganej do wywołania obserwowanej zmiany częstotliwości haplotypu (patrz poniżej).
każda rozwijająca się linia reprezentuje jednostkę obserwacyjną w naszym projekcie, dlatego analizowaliśmy nasze dane za pomocą powtarzanych pomiarów ANOVAs (tj. wewnątrz-badanych ANOVAs). Tutaj każda linia reprezentuje podmiot, a częstotliwość początkowa HI (0,2 lub 0,8) i warunki środowiskowe (jednorodne lub niejednorodne) były dwoma czynnikami międzyosobniczymi, a dwa powtórzone miary (Δf lub SI) podejmowane w różnych odstępach pokoleniowych były traktowane jako czynnik wewnątrzosobniczy. W tych analizach, czynniki ogniskowe między-testowe sprawdzają efekty naszych eksperymentalnych zabiegów, a czynniki wewnątrz-testowe sprawdzają, czy wzór ewolucji zmienił się w trakcie naszego eksperymentu. Ta strategia analityczna opiera się na fakcie, że śledzimy dynamikę częstotliwości w replikowanych i niezależnych liniach, a nie-ogniskowy efekt losowego dryfu genetycznego, który jest przewidywany jako istotny dla dynamiki mtDNA, stanowi część pozostałego terminu naszych modeli wnioskowania. Konwencjonalne testy F dotyczące czynników międzyosobniczych zwalidowano za pomocą testów permutacji, opartych na 9999 losowych permutacjach danych. Średnie SI dla różnych grup oceniano na podstawie 95% CI z 9999 replikatów danych bootstrap.
szacunki siły selekcji zależnej od częstotliwości
chcieliśmy również dokładniej ocenić, czy siła selekcji zależnej od częstotliwości HI I HII różniła się w dwóch eksperymentalnych metodach środowiskowych (jednorodnych / heterogenicznych). Aby na to pozwolić, wyciągnęliśmy proste miary selekcji zależnej od częstotliwości z naszych danych empirycznych, używając następującego uzasadnienia. Wcześniejsze wyraźne modelowanie danych nieeksperymentalnych w tym systemie wykazało, że najlepsze dopasowanie do dynamicznych danych dotyczących częstotliwości haplotypu występuje wtedy, gdy nie ma pozytywnej lub negatywnej selekcji dla tych haplotypów mtDNA, ale gdy istnieje negatywna selekcja zależna od częstotliwości, która jest równie silna dla obu haplotypów . Rozważamy dwa haplotypy mtDNA HI I HII, z częstotliwościami pI i pII (pI + PII = 1) i dopasowaniami WI i WII. Zmiana na generację w pI jest następnie podawana przez
$$ \Delta {p}_i=\frac{p_I{p}_{II}\left({w}_i-{W}_{II}\right)}{\overline{w}} $$
obserwacje z obu naturalnych populacji (patrz Rys. 1; dodatkowy plik 1) i replikowane populacje klatek laboratoryjnych sugerują również, że selekcja jest symetryczna z równowagą dla dwóch haplotypów HI I HII w pobliżu pI = pII = 0,5. Zakładając (i) częstotliwość równowagi pI = pII = 0.5, (ii) że przydatność haplotypu jest liniowo związana z częstotliwością haplotypu i (iii) że wybór jest symetryczny, z czego wszystkie są poparte wcześniejszymi badaniami, osiągamy
$$ {W}_i=1 – {p} _i{s} _I $$
$$ {W}_{II} = 1 – {p}_{II} {s} _I $$
gdzie sI jest zależnym od częstotliwości współczynnikiem doboru. Biorąc pod uwagę, że \ (\overline{W}={p} _I{w} _i+{p} _ {II} {w} _ {II}\) możemy następnie oszacować sI na podstawie naszych empirycznych obserwacji ΔpI jako
$$ {s}_i=\frac{-\Delta {p}_i{p}_i-\Delta {P}_i{P}_{II}}{-\Delta {P}_i{p_{II}}^2-{p_i{p}_{II}}^2+{p_i}^2{P}_{II}-\Delta {p}_i{p_i}^2} $$
zdefiniowany w ten sposób, sI przyjmuje dowolną skalę, ale jest dodatni, gdy ΔpI zmienia się w kierunku atraktora i ujemny, gdy zmienia się w kierunku atraktora. Dla każdej klatki oszacowaliśmy dwie niezależne powtarzające się miary sI na podstawie obserwowanych zmian częstotliwości haplotypu między pokoleniami odpowiednio 0-5 i 5-10. Zauważamy, że nasza miara będzie dokładna, gdy prawdziwa równowaga jest bliska pI = pII = 0,5, ale bardziej przybliżona, jeśli prawdziwa równowaga odbiega od tego warunku.
