streszczenie
wirus grypy neuraminidaza (na) odgrywa zasadniczą rolę w uwalnianiu i rozprzestrzenianiu się wirionów potomnych po wewnątrzkomórkowym cyklu replikacji wirusa. Aby sprawdzić, czy NA może również ułatwiać przedostawanie się wirusa do komórki, zainfekowaliśmy Kultury nabłonka ludzkich dróg oddechowych wirusami grypy ludzkiej i ptasiej w obecności inhibitora NA karboksylanu oseltamiwiru. Dwadzieścia do 500-krotnie mniej komórek zostało zakażonych w kulturach leczonych lekiem w porównaniu do kultur nietrealizowanych (P < 0,0001) 7 h po podaniu wirusa, co wskazuje, że lek hamował inicjację zakażenia. Dane te wykazują, że wirusowe NA odgrywa rolę we wczesnym stadium zakażenia i dostarczają dalszych przesłanek do profilaktycznego stosowania inhibitorów NA.
uważa się, że główną funkcją wirusowej neuraminidazy (NA) jest końcowy etap zakażenia, gdy NA rozszczepia kwas sialowy z powierzchni komórki i wiriony potomne ułatwiające uwalnianie wirusa z zakażonych komórek (1, 2). Mniej wiadomo o funkcjach NA podczas wnikania wirusa do komórki. Od dawna przyjmuje się, że NA Promuje dostęp wirusa do komórek docelowych w drogach oddechowych poprzez degradację śluzu (3). Koncepcja ta jednak nigdy nie została formalnie udowodniona z powodu braku odpowiedniego systemu eksperymentalnego. Ponadto zgłoszono pewne dowody przemawiające przeciwko roli NA we wczesnych stadiach zakażenia (recenzja w punkcie 2).
aby rozwiązać ten problem, badaliśmy wpływ inhibitora KARBOKSYLANU oseltamiwiru (OC) (9) na wejście wirusa grypy do kultur nabłonka ludzkich dróg oddechowych. Pierwotne ludzkie komórki nabłonka tchawiczo-oskrzelowego (HTBE; Clonetics) i pierwotne komórki nabłonka nosowego (PromoCell GmbH) hodowano na podporach membranowych (12-mm Transwell-Clear; Corning, Inc.) na styku powietrze-ciecz w surowiczym czynniku wzrostu i pożywce uzupełnionej hormonem (6, 8). Do wszystkich eksperymentów wykorzystano w pełni zróżnicowane Kultury w wieku od 4 do 8 tygodni. Kultury te były pseudostratyfikowane i spolaryzowane; zawierały komórki podstawne, rzęskowe i wydzielające śluz; i bardzo przypominały nabłonek dróg oddechowych człowieka in vivo (Fig. 1). OC (1 µM, jeśli nie wskazano inaczej) dodano do zawiesin wirusa i do bazolateralnych komór kultur na krótko przed zakażeniem dwóch replikowanych kultur od strony wierzchołkowej. Dwie kultury kontrolne zostały zakażone w przypadku braku inhibitora. Godzinę po zakażeniu usunęliśmy inokulum wirusa i inkubowaliśmy kultury na styku powietrze-ciecz przez dodatkowe 6 godzin, aby umożliwić wewnątrzkomórkową replikację wirusa. Hodowle następnie utrwalono, a zainfekowane komórki zidentyfikowano poprzez barwienie poliklonalnymi antysurowicami całych wirusów, a następnie odpowiednimi drugorzędowymi przeciwciałami znakowanymi peroksydazą (Dianova) i substratem aminoetylokarbazolu (Sigma). Dodatnie zabarwienie wskazywało na udane wejście wirusa do komórki. Kultury analizowano en face w powiększeniu ×300 (Olympus IMT-2). Całkowita liczba komórek wykazujących ekspresję antygenu wirusowego została policzona w segmencie nabłonka, który obejmował wszystkie kolejne mikroskopowe widoki (0,28 na 0,42 mm) wzdłuż średnicy hodowli (powierzchnia segmentu, 3 mm2; liczba komórek na segment, około 30 000). Cztery segmenty na kulturę liczono obracając kulturę zgodnie z ruchem wskazówek zegara o 45o. uśredniono dane dla ośmiu segmentów dwóch replikowanych kultur.
w dwóch eksperymentach z użyciem kultur HTBE ludzki wirus A/Memphis/14/96 (H1N1) zainfekował 22 – i 65-krotnie mniej komórek w obecności inhibitora NA w porównaniu z grupą kontrolną (Fig. 2; Tabela 1) (P < 0, 0001). Wirusy a/Duck/Alberta/119/98 (H1N1) z dzikiego ptaka wodnego i A/Turkey/Italy/2379/99 (H7N1) z drobiu domowego były również w tych kulturach wyraźnie wrażliwe na OC. W hodowlach nabłonka nosa OC zmniejszyło odpowiednio 120 – i 520-krotne zakażenie wirusem ludzkim i kaczym. Wyniki te wskazują, że hamowanie wirusowego NA hamuje rozpoczęcie zakażenia wirusowego.
a/Chicken/Germany/R28 / 03 (H7N7) należy do linii wysoce zjadliwej grypy ptaków, która w 2003 r.wywołała epidemię dżumy drobiu w komercyjnych gospodarstwach drobiarskich w Niderlandach, Belgii i Niemczech. Wirusy te zostały przeniesione na co najmniej 89 ludzi, z których większość cierpiała na zapalenie spojówek, ale wystąpił również jeden śmiertelny przypadek zapalenia płuc (5). Zakażenie wirusem h7n7 kurcząt w hodowlach HTBE zmniejszyło się 140 – i 40-krotnie w obecności odpowiednio 1 i 0,1 µM OC. Stężenia te reprezentowały typowe maksymalne i minimalne stężenia leku w osoczu osiągane u ludzi po podaniu 75 mg fosforanu oseltamiwiru, zalecanej dawki w profilaktyce (9).
aby potwierdzić hipotezę, że hamowanie infekcji w naszych eksperymentach było bezpośrednio związane z hamowaniem aktywności enzymatycznej wirusa NA, użyliśmy ludzkiego a / Sydney/5/97-podobnie jak wirus (H3N2) i jego mutant oporny na oseltamiwir z podstawieniem R292K w NA, co czyni NA 9000 razy mniej wrażliwym na hamowanie przez OC (4). Zgodnie z hipotezą, macierzysty ludzki wirus był silnie hamowany przez OC, podczas gdy zaobserwowano tylko marginalny poziom hamowania opornego mutanta, gdy oba wirusy były testowane w tym samym eksperymencie w kulturach HTBE (Tabela 1). Do tej pory nie był dostępny odpowiedni test hodowli komórkowej do monitorowania oporności wirusa grypy na inhibitory NA z powodu niedopasowania między receptorami kwasu sialowego u ludzi i w konwencjonalnych laboratoryjnych liniach komórkowych (9, 11). Nasze wyniki sugerują, że zróżnicowane Kultury nabłonka dróg oddechowych człowieka mogą być odpowiednim systemem hodowli komórkowej do wykrywania oporności wirusa grypy na inhibitory NA.
wreszcie, za pomocą leku wrażliwe a / Sydney/5/97-podobnie jak wirus, testowaliśmy hamowanie infekcji przez OC dodawane w różnych okresach po zaszczepieniu wirusa. Podczas gdy 47-krotnie mniej komórek zostało zakażonych po dodaniu leku na krótko przed zakażeniem, 1-godzinne opóźnienie w połączeniu z OC spowodowało tylko 1,5-krotne zahamowanie w odniesieniu do nietreated control(Tabela 1). Jeśli lek dodano 4 godziny po zaszczepieniu wirusa, nie zaobserwowano statystycznie istotnego hamowania. Dane te sugerują, że OC miało wpływ na najwcześniejsze stadia infekcji poprzedzające replikację wirusa.
podsumowując, przedstawiliśmy tutaj po raz pierwszy bezpośrednie eksperymentalne dowody na zasadniczą rolę NA na etapie inwazji wirusa nabłonka rzęskowego ludzkich dróg oddechowych. Funkcja NA na tym etapie polega najprawdopodobniej na usunięciu receptorów wabików na mucynach, rzęskach i glikokaliksach komórkowych, z których silne wiązanie utrudniłoby wirusowi dostęp do funkcjonalnych receptorów na błonie powierzchniowej komórek docelowych. Jednakże nie można wykluczyć innych funkcji NA—na przykład promowania fuzji za pośrednictwem hemaglutyniny (7)-i potrzebne są dalsze badania w celu określenia dokładnych mechanizmów, za pomocą których NA Promuje wnikanie wirusa do komórek nabłonkowych dróg oddechowych.
bez jeszcze dostępnej szczepionki przeciwko wysoce zjadliwym wirusom ptasiej grypy H7N7 i H5N1, leki przeciwwirusowe pozostają jedyną opcją zwalczania ptasiej grypy (10). W porównaniu z innymi lekami przeciw grypie, inhibitory NA są dobrze tolerowane i skuteczne wobec wszystkich szczepów wirusów grypy A I B. Istnieją niewielkie dowody na pojawienie się oporności wirusowej, a zakaźność zmutowanych wirusów jest zwykle zagrożona (9, 11). Zdolność inhibitorów NA do tłumienia infekcji przed wniknięciem wirusa do komórek podkreśla ich wysoki potencjał środków zapobiegawczych. W szczególności nasze dane stanowią podstawę naukową do wsparcia profilaktycznego stosowania tych związków u osób z wysokim ryzykiem zakażenia wirusami ptasiej grypy.
