N-końcowe sekwencjonowanie, często określane jako Edman sekwencjonowanie lub Edman degradacja jest ważną techniką w badaniu białek i pozostaje unikalnym podejściem, które może przynieść nowe dane sekwencji białek. Jest to również preferowana technika szybkiego potwierdzenia ekspresji białka.
Chemia tego podejścia została po raz pierwszy wprowadzona w 1950 roku przez P. Edmana z Uniwersytetu w Lund w Szwecji i dalej rozwijana podczas jego pracy w Melbourne w Australii do tego, co uważa się za pierwsze zautomatyzowane urządzenie do sekwencjonowania peptydów.
Chemia Edmana
Rys. 1. Edman degradation chemistry for N-terminal protein sequencing.
reakcje chemiczne, które dają hydrolizowany N-końcowy znakowany aminokwas, przedstawiono na fig. Każdy cykl obejmuje zasadniczo 3 kroki:
- sprzęganie fenyloizotiocyjanianu (PITC, odczynnik Edmana) z alfa-aminą łańcucha polipeptydowego w Warunkach podstawowych w celu utworzenia ugrupowania fenylotiokarbamylowego (PTC).
- rozszczepienie w łagodnych warunkach kwaśnych generuje wolny koniec aminowy na polipeptydzie i addukowanym aminokwasie anilinotiazolinonu (ATZ).
- ta ostatnia jest ekstrahowana i dalej przekształcana w bardziej stabilną pochodną fenylotiohydantoiny (PTH).
otrzymaną pozostałość PTH analizuje się za pomocą HPLC i czasów retencji w porównaniu do wzorcowych aminokwasów PTH.
reakcje uboczne i produkty uboczne
cykl sekwencjonowania Chemia i praca jest dobrze kontrolowana i daje doskonale zdefiniowane gatunki, istnieje kilka produktów ubocznych, które są wykrywane podczas analizy.
jak pokazano na fig. 2, pochodzą one głównie z hydrolizy PITC i metanolizy podczas cyklu i obejmują difenylotiomocznik (DPTU), N-fenyl, o-metylo-tiokarbonian (PMTC) i difenylomocznik (DPU), produkty uboczne, które współwystępują i współwystępują z aminokwasami PTH.
