Krótkie wprowadzenie: techniki blottingu
Blotting jest stosowany w biologii molekularnej do identyfikacji białek i kwasów nukleinowych i jest szeroko stosowany do celów diagnostycznych. Technika ta unieruchamia interesującą cząsteczkę na podłożu, którym jest membrana nitrocelulozowa lub nylon. Wykorzystuje techniki hybrydyzacji do identyfikacji specyficznych kwasów nukleinowych i genów.
technika blottingu jest narzędziem stosowanym w identyfikacji biomolekuł takich jak ad DNA, mRNA i białko podczas różnych etapów ekspresji genów. Synteza białek polega na ekspresji segmentu DNA, który przekształca się w mRNA w celu wytworzenia odpowiedniego białka.
podtypy plamienia, takie jak Północny, Zachodni & Południowy, zależą od poszukiwanej cząsteczki docelowej. Gdy sekwencja DNA jest fundamentem lub kodem dla cząsteczki białka, konkretna cząsteczka DNA będąca przedmiotem zainteresowania może być blotowana przy użyciu techniki Southern Blotting. Podczas ekspresji genu, gdy DNA jest wyrażane jako mRNA dla produkcji białka, proces ten może być zidentyfikowany przez Northern blotting. Wreszcie, kodowany mRNA produkuje dane białko, ta identyfikacja białka może być wykonana przez Western Blotting.
ogólna procedura blotowania
- Homogenizuj próbkę.
- rozdzielenie interesującej cząsteczki przez membranę elektroforezy.
- przenoszenie cząsteczek do membrany nitro-celulozowej / membrany nylonowej.
- hybrydyzacja lub identyfikacja cząsteczki
Northern Blotting
Northern Blotting jest techniką stosowaną do badania ekspresji genów. Odbywa się to poprzez wykrycie określonego RNA (lub wyizolowanego mRNA). mRNA jest zwykle reprezentowane jako 5% ogólnej sekwencji RNA. Metoda ta ujawnia tożsamość, liczbę, aktywność i rozmiar danego genu. Ta technika blotting może być również stosowany do wzrostu tkanki lub organizmu. W różnych stadiach różnicowania i morfogenezy zmienia się obfitość RNA i można to zidentyfikować za pomocą tej techniki. Pomaga również w identyfikacji nieprawidłowego, chorego lub zakażonego stanu na poziomie molekularnym. Technika northern blot została opracowana w 1977 roku przez Jamesa Alwine 'a, Davida Kempa i George’ a Stanka na Uniwersytecie Stanforda. Technika ta otrzymała swoją nazwę ze względu na podobieństwo procesu Do Southern blotting. Podstawową różnicą między tymi dwoma technikami jest to, że northern blotting dotyczy tylko RNA.
zasada
jak każda normalna technika blottingu, blotting północny rozpoczyna się od elektroforezy w celu oddzielenia próbek RNA według wielkości. Elektroforeza oddziela cząsteczki RNA na podstawie ładunku kwasów nukleinowych. Ładunek w kwasach nukleinowych jest proporcjonalny do wielkości sekwencji kwasu nukleinowego. W ten sposób błona elektroforezy oddziela sekwencję kwasu nukleinowego w zależności od wielkości sekwencji RNA. W przypadkach, gdy sekwencją docelową jest mRNA, próbkę można wyizolować za pomocą technik chromatograficznych oligo celulozy, ponieważ mRNA charakteryzują się Poli(a)-ogon. Ponieważ cząsteczki żelu są kruche z natury, oddzielone sekwencje są przenoszone do membran nylonowych. Dobór membrany nylonowej przyczynia się do tego, że kwasy nukleinowe są ujemnie naładowane w przyrodzie. Po przeniesieniu cząsteczek RNA jest on unieruchamiany przez wiązanie kowalencyjne. Następnie dodaje się sondę, sonda może być komplementarna sekwencją DNA ss. Formamid jest zwykle stosowany jako bufor blotting, ponieważ zmniejsza temperaturę wyżarzania.
procedura
- pobrana próbka tkanki lub kultury jest najpierw homogenizowana. Próbki mogą być reprezentatywne dla różnych rodzajów kultury do porównania lub może być do badania różnych etapów wzrostu wewnątrz Kultury.
- Sekwencja RNA jest rozdzielana w jednostce elektroforezy, żel agarozowy jest używany do rozdzielania kwasu nukleinowego.
- teraz oddzielona Sekwencja RNA jest przenoszona do błony nylonowej. Odbywa się to za pomocą dwóch mechanizmów działania kapilarnego i interakcji jonowej.
- operacja transferu odbywa się przez utrzymywanie żelu w następującej kolejności. Najpierw żel agarozowy umieszcza się na dnie stosu, a następnie na błonie blotującej. Na tych ręcznikach papierowych umieszczony jest łagodny ciężar (szklany talerz). Cała konfiguracja jest przechowywana w zlewce zawierającej bufor transferowy.
- RNA przenoszone na membranę nylonową jest następnie mocowane za pomocą promieniowania UV.
- stała membrana nylonowa jest następnie mieszana z sondami. Sondy są specjalnie zaprojektowane dla genu będącego przedmiotem zainteresowania, tak że będą hybrydyzować z sekwencjami RNA na blocie odpowiadającym sekwencji będącej przedmiotem zainteresowania.
- membrana blot jest przemywana w celu usunięcia niechcianej sondy
- oznakowana sonda jest wykrywana przez chemiluminescencję lub autoradiografię. Rezultatem będą ciemne pasma w filmie X ray.
żel i sondy
próbki RNA są rozdzielane za pomocą żeli agarozowych z formaldehydem jako środkami denaturującymi, ale w małych sekwencjach RNA lub mikro RNA można również stosować sekwencje poliakrylamidowe z mocznikiem jako środkiem denaturującym. Bromek etydyny może być stosowany jako środek barwiący. Dwa rodzaje znaczników są do oznaczania rozmiaru. Drabinka RNA i podjednostka rybosomalna są używane do identyfikacji wielkości sekwencji RNA.
sondy mogą być komplementarne do całości lub części interesującego RNA. Mogą to być RNA, DNA lub oligonukleotydy 25 komplementarnych baz do docelowego RNA. W przypadku sond RNA stosuje się sondy produkowane przez invitro, ponieważ sondy invivo mogą ulegać denaturacji ze względu na rygorystyczne mycie. W przypadku cDNA sondy są znakowane izotopami promieniotwórczymi, fosfatazą alkaliczną lub peroksydazą chrzanową w przypadku chemiluminescencji.
